在全球，结直肠癌的发病率位居前列[1]。目前，结直肠癌的治疗手段包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等[2]。早期结直肠癌的治疗方式以手术切除为主，Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者的治疗主要是以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为基础的化疗[3]。虽然基于5-FU的化疗方案有助于提高结直肠癌患者的生存率，但5年生存率仍然很低(<14%),主要原因是由于患者出现了5-FU耐药[4]。而化疗耐药的主要机制之一是由于重要的膜蛋白的低表达导致药物运输进入肿瘤细胞的活性降低[5]。溶质载体家族6成员9(solute carrier family 6 member 9,SLC6A9)属于钠和氯依赖的质膜神经递质转运蛋白，研究表明，SLC6A9在多种肿瘤中存在差异表达，影响药物敏感性，如SLC6A9在131I耐药甲状腺癌细胞株中表达下调，通过上调SLC6A9表达能稳定131I治疗的敏感性[6]。但SLC6A9在结直肠癌中的表达，与药物疗效的相关研究鲜有报道。本研究将探讨SLC6A9在结直肠癌中的表达及相关功能，并验证其对5-FU药物敏感性的影响。

1、材料与方法

1.1 细胞及试剂

人结直肠癌细胞系HCT116、HT29、SW620、SW480和Lovo购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库；正常结肠上皮细胞NCM460购自美国ATCC细胞库；胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；靶向SLC6A9的siRNA 和SLC6A9过表达质粒以及相应的阴性对照均购自中国上海吉玛制药技术有限公司；CCK-8购自上海碧云天生物技术公司；荧光定量PCR试剂盒和反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；5-FU购自山东齐鲁药业股份有限公司；LipofectamineTM 2000购自美国赛默飞公司；Transwell小室和基质胶购自美国BD公司；一抗：SLC6A9抗体、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-链蛋白(β-catenin),二抗：HRP-山羊抗兔IgG均购自赛默飞世尔(中国)有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物试剂有限公司；RIPA和BCA试剂盒购自北京索莱宝试剂有限公司。

1.2 细胞培养

人正常结肠细胞系NCM460、结直肠癌细胞系HCT116、HT29、Lovo、SW620和SW480培养于加入10%胎牛血清及青霉素、链霉素双抗的DMEM培养基中。置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。观察细胞生长情况，生长至对数期时进行传代。

1.3 siRNA的设计与合成

靶向人SLC6A9基因的siRNA由上海吉玛公司设计与合成，设计两对siRNA,用以检测siRNA对靶基因的干扰效率，siRNA序列见表1。阴性对照组采用与靶基因检测相关基因无同源性的siRNA(Scramble)。

1.4 细胞转染及分组

取对数生长期的HT29细胞(5×104个/孔)和SW620细胞(2×105个/孔)接种于6孔板，培养细胞密度达70%～80%时，按照LipofectamineTM 2000说明书分别转染两种细胞，HT29细胞转染SLC6A9过表达质粒、空载体质粒(SLC6A9 OE组、Vector组),SW620细胞转染SLC6A9 siRNA和无义siRNA(SLC6A9 siRNA1#组、SLC6A9 siRNA2#组和Scramble组),另外同时设置Control组(只加转染试剂),转染48 h后收集细胞，用于后续功能实验。

表1 SLC6A9的siRNA序列

1.5 实时荧光定量PCR

Trizol提取细胞的总RNA, TaKaRa反转录试剂盒合成 cDNA,以cDNA为模板利用SYBR Premix Ex TaqTM在ABI 7500(Applied Biosystems)进行实时荧光定量PCR检测。PCR引物由生工生物有限公司合成。PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性10 s; 60 ℃退火30 s, 40个循环；72 ℃延伸8 min。以β-actin为标准化内参。采用2-ΔΔCT法计算SLC6A9的相对表达量。实验重复3次。引物序列见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.6 CCK-8法检测细胞活力

将HT29细胞和SW620细胞分别按1×105个/孔、5×103个/孔接种于96孔板中，对其进行转染， 实验分组如1.2.3节。采用CCK-8法检测不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L)5-FU作用48 h后的细胞活力。

1.7 伤口愈合实验

将转染后的HT29细胞(5×104个/孔)和SW620细胞(2×105个/孔)接种于6孔板中，当细胞融合时，用无菌200 μL枪头垂直划线，划痕形成后0和24 h, 拍摄划痕宽度。

1.8 Transwell检测细胞侵袭

将稀释的Materigel基质胶(1∶8)均匀铺于Transwell小室的上室膜上，备用。将转染48 h的细胞消化，制成单细胞悬液。Transwell上室接种细胞，24孔板下室加入500 μL含20%胎牛血清的细胞培养基，将含有Transwell小室的24孔板置于培养箱中培养，24 h后取出Transwell小室并擦去上室膜中未过膜细胞，用4%多聚甲醛和0.1%结晶紫分别进行固定和染色，将Transwell小室倒置于显微镜下，选取5个视野进行拍照。

1.9 蛋白印记法检测E-cadherin和Vimentin表达

采用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。上样行10%SDS-PAGE进行电泳分离蛋白，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h, 然后与抗SLC6A9的一抗(体积稀释比例为1∶1 000)和β-actin(体积稀释比例为1∶1 000)在4 ℃孵育过夜。用PBST洗膜3次，随后加入HRP-山羊抗兔IgG(体积稀释比例为1∶2 000)二抗在37 ℃孵育1 h, 用PBST洗膜3次，每次5 min。采用电化学发光法发光显影。

1.10 免疫荧光检测HT29细胞中E-cadherin和Vimentin的水平

将转染过表达SLC6A9的HT29细胞，制备细胞爬片。用预冷PBS洗3次，每次3 min, 用4%多聚甲醛固定15 min, PBS漂洗3次，用与二抗同宿主的血清，室温封闭30 min, 加入E-cadherin和Vimentin一抗(稀释比例为1∶250),4 ℃过夜；PBST洗2次， 滴加山羊抗兔IgG (稀释比例为1∶100),37 ℃避光孵育1 h, PBST洗3次，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI),室温避光反应15 min, 对细胞核进行染色，PBST 5 min 4次洗去多余的DAPI。在荧光显微镜下观察采集图像。

1.11 动物实验

建立HT29肿瘤模型，观察SLC6A9在裸鼠体内对结直肠癌细胞对5-FU敏感性的调节作用。动物手术经我院委员会批准，按照2009年《中华人民共和国动物保护法》的指导原则进行。6周龄雌性裸鼠在受控的光照条件下饲养，并允许随意喂养。裸鼠平均体重20 g, 购自北京维通利华实验动物科技有限公司。异种移植瘤通过双侧腹肋下皮下分别注射1.0×106个/mL HT29细胞和HT29 SLC6A9过表达细胞，每日按时观察成瘤情况，皮下接种6 d后，可触及肿瘤，肿瘤大小每3 d用线性卡尺测量一次。使用以下公式计算肿瘤体积：长×宽2/2。在裸鼠成 瘤6 d后开始用5-FU (50 mg/kg)治疗，每3 d一次，腹腔注射至18 d, 实施安乐死并取出瘤体称重。

1.12 统计学方法

采用Prism GraphPad 6.0 软件进行统计学分析。数据为平均数±标准差表示。两组间的比较采用独立样本t检验。多组间差异采用单因素方差分析，用LSD-t法进行组间两两比较。以P<0.05认为差异具有统计学意义。所有实验重复3次。

2、结果

2.1 SLC6A9在结肠癌组织和结直肠癌细胞中的表达

首先，我们分析了SLC6A9在结肠癌组织中的表达情况，通过GEPIA分析TCGA数据库286例结肠癌组织和41例正常组织中SLC6A9的表达，结果发现，SLC6A9在结肠癌组织中的表达水平显著低于正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05,图1A)。

接下来，我们进一步利用实时荧光定量PCR检测SLC6A9在结直肠癌细胞系中的表达，证实了与正常结肠上皮细胞NCM460(1.00±0.00)相比，SLC6A9在结直肠癌细胞系SW620、HCT116、HT29、Lovo和SW480中表达降低(图1B),表达量分别为 0.67±0.05、 0.59±0.05、0.25±0.03、0.44±0.04、0.28±0.04。Western blot检测SLC6A9蛋白在结直肠癌细胞系中的表达水平，以β-actin为内参，发现SLC6A9在结直肠癌细胞系中的表达量显著低于正常结肠细胞系(图1C),与荧光定量结果一致。其中SW620细胞和HT29细胞中SLC6A9表达量最多和最少，因此，后续选择这两种细胞进行沉默和过表达。

图1 SLC6A9在结肠癌组织和结直肠癌细胞系中的表达   

2.2 SLC6A9表达影响结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力

为了检测SLC6A9表达对结直肠癌细胞功能的影响，我们对HT29细胞和SW620细胞分别进行过表达和沉默。转染了siSLC6A9后，与阴性对照组相比，细胞的伤口愈合速度增快，细胞侵袭数量增加(图2A-B)。而转染过表达SLC6A9质粒后，细胞伤口愈合速度低于对照组，细胞侵袭数量同样低于对照组(图2C-D)。

图2 SLC6A9表达影响结直 肠癌细胞的迁移、侵 袭能力(结晶紫染色)   

2.3 SLC6A9表达影响结直肠癌细胞上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition, EMT)进程

为了研究SLC6A9是否参与结直肠癌细胞的EMT进程，将HT29和SW620细胞进行过表达和沉默后。利用Western blot检测EMT标志物蛋白(E-cadherin、Vimentin)的表达水平，结果发现，与Vector组相比，在转染过表达SLC6A9的细胞中，E-cadherin表达水平显著升高，而Vimentin表达水平显著下降(图3A)。而转染两对SLC6A9 siRNA后，结果发现siRNA1#(siRNA559)、siRNA2#(siRNA1818)均能抑制SLC6A9基因的表达，且两组E-cadherin表达水平显著降低，而Vimentin表达水平显著升高(图3B)。进一步采用免疫荧光技术检测SLC6A9过表达时E-cadherin和Vimentin的表达水平，结果表明，与Vector组相比，SLC6A9过表达时，E-cadherin表达水平增加，而Vimentin表达水平降低(图3C)。以上结果说明SLC6A9过表达会抑制结直肠癌细胞EMT进程。

2.4 SLC6A9表达影响结直肠癌 细胞对5-FU的药 物敏感性

接下来，验证SLC6A9表达是否影响5-FU对结直肠癌细胞的药物敏感性，用不同浓度的5-FU处理过表达SLC6A9的HT29细胞和沉默SLC6A9的SW620细胞后，利用CCK-8检测细胞活力，结果发现SLC6A9过表达能够显著抑制HT29细胞的活性，差异具有统计学意义(P<0.01,图4A);而沉默SLC6A9的SW620细胞活性增加，差异具有统计学意义(P<0.05,图4B)。这说 明SLC6A9过表达能增加 5-FU对结直肠癌细胞的药物敏感性，降低细胞活性。

图3 SLC6A9表达影响结直肠癌细胞EMT进程   

2.5 裸鼠体内SLC6A9过表达对5-FU疗效的影响

为了进一步评估裸鼠体内SLC6A9过表达对5-FU治疗疗效的影响，利用转染SLC6A9过表达载体的HT29 细胞建立了体内异种移植模型，同时给予50 mg/kg的5-FU进行治疗(图5A)。结果表明给予同样剂量的5-FU治疗后，与对照组相比，转染了SLC6A9过表达载体的HT29细胞建立的异种移植物的肿瘤体积明显降低(图5B-C,P<0.05),HT29对照组在终点处的平均肿瘤质量为(0.64±0.13)g, HT29 SLC6A9 OE组在终点处的平 均肿瘤质量为 (0.18±0.04)g。这说明SLC6A9过表达可增加5-FU对结直肠癌的治疗疗效，抑制肿瘤生长。

3、讨论

结肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一。尽管迄今为止结肠癌治疗取得令人鼓舞的进展，患者从基于5-FU的治疗中获益，但往往因化疗耐药性的发展而受到损害[7]。溶质载体(solute carrier family, SLC)家族蛋白是最大的转运蛋白，它能够输送多种基质，包括药物[8]、神经递质[9]、营养素和离子[10]。SLC在癌症中异常表达导致细胞稳态发生变化，从而在癌症耐药性中发挥作用[11]。例如：CHEN等人[12]研究发现SLC6A1在前列腺癌组织中表达上调，而SLC6A1过表达增强前列腺癌对多西他赛的耐药性。JANUCHOWSKI等人[13]报道，SLC6A1显著增加了W1卵巢癌细胞对拓扑替康化疗的耐药性。以上研究结果均表明SLC转运蛋白在药物敏感性的调节中至关重要。

图4 SLC6A9表达影响5-FU对结直肠癌细胞的药物敏感性   

图5 裸鼠体内验证SLC6A9过表达对5-FU 疗效的影响   

本研究通过TCGA数据库分析了SLC6A9在结肠癌组织中的表达，结果显示SLC6A9在结肠癌组织中的表达明显低于正常组织。接下来，继续验证了SLC6A9在结直肠癌细胞系中的表达，结果发现SLC6A9在结直肠癌细胞系中下调。为了进一步探讨SLC6A9表达对细胞功能的影响，本研究利用HT29细胞和SW620细胞分别进行过表达和敲除进行功能分析，结果显示，当SLC6A9过表达时，抑制了HT29细胞迁移、侵袭能力；而敲除SLC6A9时，促进了SW620细胞迁移、侵袭能力。这表明SLC6A9的表达影响结直肠癌细胞的迁移、侵袭。

结肠癌容易发生转移也是影响患者生存率的重要原因[14]。EMT受到多种细胞因子的调节影响发育、癌症进展和组织修复[15],是发生转移的重要先决条件[16]。研究表明，EMT的异常激活在促进化疗耐药性增强、迁移和侵袭中发挥重要作用[17,18,19]。在本实验中，当过表达SLC6A9时，EMT相关标志物E-cadherin表达水平增加，而Vimentin表达水平降低，沉默SLC6A9时，结果与之相反，说明SLC6A9过表达能够抑制结直肠癌的转移。

在本实验中发现SLC6A9过表达能够增加5-FU对结直肠癌细胞的药物敏感性，敲除SLC6A9则会降低5-FU对直结肠癌细胞的药物敏感性。进一步利用人结直肠癌裸鼠荷瘤模型，观察到SLC6A9过表达能够增加5-FU对结直肠癌的治疗疗效，抑制肿瘤生长。

综上所述，SLC6A9在结肠癌组织和结直肠癌细胞系中低表达，过表达时可以抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭和EMT进程并增强5-FU对结直肠癌细胞的药物敏感性。

参考文献:

[4]谢竹夫,姚菲,吴清明.基于生物信息学和转录组测序分析结直肠癌5-FU耐药关键靶点[J].现代肿瘤医学,2022,30(23):4226-4232.

[15]张晓林,吴浩松,汪盛.SLC12A8通过JAK/STAT途径促进膀胱癌细胞的增殖､侵袭与迁移并触发上皮间充质转化[J].南方医科大学学报,2023,43(9):1613-1621.

[18]徐园园,唐清珠,邓加雄,等.AEBP1通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控EMT促进结肠癌细胞增殖迁移[J].现代肿瘤医学,2021,29(14):2393-2400.

[19]党锋,杨坤荣,刘文聘,等.柴胡皂苷D通过抑制EMT和细胞干性抑制人结直肠癌细胞SW480的迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2020,28(7):1091-1096.

基金资助:黑龙江省自然科学基金联合引导项目(编号:LH2019H079);

文章来源:张岩,田素礼,周勇旭等.SLC6A9对结直肠癌细胞生长和对5-FU药物敏感性的影响[J].现代肿瘤医学,2024,32(07):1236-1241.