结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，我国结直肠癌的发病率约为28/10万人，仅低于肺癌、胃癌[1]。化疗是结直肠癌主要的治疗手段，但耐药性始终是一个难题。明确结直肠癌化疗耐药发生机制对逆转耐药、改善患者预后具有重要意义。当归多糖是来源于当归的一种活性多糖，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性，可能与其抗炎、免疫调节、抑制肿瘤血管生成等活性有关。相关研究[2]显示，当归多糖可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，抑制肿瘤血管生成；此外，当归多糖还可以增强免疫功能，提高机体对肿瘤的抵抗力。但目前关于当归多糖在逆转结直肠癌顺铂耐药性方面作用的研究十分少见。微小RNA(miRNA)异常表达参与恶性肿瘤的病情发展和化疗耐药性的产生[3]。本研究主要探讨当归多糖对顺铂耐药细胞株HT-15/DDP耐药性的影响及作用机制。

1、材料与方法

1.1细胞与主要试剂

人结直肠癌细胞HT-15、顺铂耐药细胞株HT-15/DDP(上海澳睿赛生物技术有限公司);当归多糖(批号：20220611,成都曼思特生物科技有限公司);顺铂(江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20040813,6 mL30 mg);RPMI-1640培养基、胎牛血清(上海科拉曼试剂有限公司);Trizol试剂、一步法cDNA反转录试剂盒(北京大智科创科技有限公司);RIPA细胞裂解液、BCA试剂盒(广州吉赛生物科技有限公司);兔抗人TGFBR2单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗体IgG(上海雅酶生物医药科技有限公司)。

1.2方 法

1.2.1细胞培养与分组

将HT-15、HT-15/DDP细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、37℃5% CO2培养箱中孵育，每24～48 h更换1次培养液，细胞融合超过80%后进行消化、传代。

对照组仅使用30μmol/L浓度顺铂干预HT-15细胞、HT-15/DDP细胞；使用对应质量浓度1.0、1.5、2.0 mg/mL的当归多糖干预12 h后再加入30μmol/L浓度顺铂为当归多糖组。通过脂质体细胞转染技术分别将miR-10b-5p inhibitor、TGFBR2 mimics转染至HT-15/DDP细胞中，再加入2.0 mg/mL当归多糖干预48 h,然后将其分为当归多糖(2.0 mg/mL)+miR-10b-5p inhibitor组、当归多糖(2.0 mg/mL)+TGFBR2 mimics组。

1.2.2细胞增殖能力检测

取各组细胞，经消化后按1×105/mL密度接种到96孔板中，加入RPMI-1640完全培养基孵育24 h,吸取上清液；每孔加入20μL MTT溶液，继续孵育6 h;每孔加入二甲基亚砜150μL,振荡混匀10 min;在酶标仪中读取490 nm波长处吸光度值，同时设置RPMI-1640完全培养基正常培养的HT-15细胞、HT-15/DDP细胞为对照组。细胞增殖率=(试验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

1.2.3细胞迁移能力检测

使用3μm孔径的Transwell小室进行细胞迁移试验。试验前先使用无血清的RPMI-1640培养基饥饿培养24 h,胰酶消化后用无血清的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为4×105个/100μL;取其中50μL稀释到200μL,加入Transwell小室的上室，下室中加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，常规培养12 h;用棉签将上室中的细胞擦去，下室中的细胞进行1%结晶紫染色，显微镜下选取4～5个视野计数。

1.2.4细胞凋亡能力检测

取各组细胞，按1×105/mL的密度接种到96孔板中，加入完全培养基，孵育24 h;离心后弃去培养液，Annexin V Binding Buffer (10×)工作液将细胞重悬，加入Annexin V-PE/7-AAD荧光双染色剂各5μL,避光静置20 min;再次加入工作液过滤后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 RT-PCR检测miR-10b-5p、TGFBR2 mRNA表达水平

使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA,使用一步法cDNA反转录试剂盒得到cDNA,使用RT-PCR试剂盒检测miR-10b-5p、TGFBR2 mRNA表达水平，以U6为miR-10b-5p的内参对照，GAPDH为TGFBR2的内参对照。miR-10b-5p上游引物：5′-GATGGACGTGATATTCGTGAAAT-3′,下游引物：5′-ATTTCACGAATATCACGTCCATC-3′。TGFBR2上游引物：5′-CGTATCCTGCGAGAGACAGTGCGCAA-3′,下游引物：5′-CCTAGAGGGTACACGAAACTTGCGCA-3′。内参U6上游引物：5′-CTCTTTCAAAATCGTGCACT A-3′,下游引物：5′-GACATGCATCAGCCTCTCTAAC-3′。内参GAPDH上游引物：5′-GTTCCATTGCGTAT GCCTATCGAT-3′,下游引物：5′-CGAACGTTATTCA GTTCGAATGCA-3′。反应35个循环，2-ΔΔCT法定量计算miR-10b-5p、TGFBR2 mRNA的表达水平。

1.2.6 Western blot检测TGFBR2蛋白表达水平

应用RIPA细胞裂解液提取细胞中的蛋白质，进行电泳和转移，使用含5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗溶液：兔抗人TGFBR2单克隆抗体，(稀释倍数：1500)、兔抗人GAPDH单克隆抗体(稀释倍数：11 000),4℃过夜孵育。将样本在转移电网上进行转移，转移过程中保持恒定电压；转移结束后加入二抗，稀释倍数为14 000,4℃过夜孵育；清洗后加底物显色，观察到相应的蛋白质条带；将显影液加到样本中，室温孵育一段时间后，观察底物显影板，拍照记录结果后进行数据分析。

1.3统计学分析

应用SPSS 25.0对数据进行处理与统计学分析。本研究数据符合正态分布，以均数±标准差(

±s)表示，两组间样本均数比较采用两独立样本t检验；多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结 果

2.1当归多糖对HT-15细胞、HT-15/DDP细胞增殖、迁移的影响

本研究结果显示，单独顺铂干预的对照组HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显高于HT-15细胞(P<0.01);经不同质量浓度当归多糖预处理12 h后，明显增强了HT-15/DDP细胞对顺铂的敏感性，HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显降低(P<0.01),其中质量浓度为2.0 mg/mL的当归多糖预处理12 h后HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数与HT-15细胞之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1当归多糖对HT-15细胞、HT-15/DDP细胞增殖、迁移的影响

2.2当归多糖对HT-15细胞、HT-15/DDP细胞凋亡的影响

本研究结果显示，单独顺铂干预的对照组HT-15/DDP细胞凋亡率明显低于HT-15细胞(P<0.01);经不同质量浓度当归多糖预处理12 h后，明显增强了HT-15/DDP细胞对顺铂的敏感性，HT-15/DDP细胞凋亡率明显升高(P<0.01),其中，用质量浓度为2.0 mg/mL的当归多糖预处理12 h后HT-15/DDP细胞凋亡率与HT-15细胞之间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.3当归多糖对HT-15/DDP细胞miR-10b-5p、TGFBR2表达的影响

本研究结果显示，HT-15/DDP细胞miR-10b-5p、TGFBR2表达水平在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01);不同剂量当归多糖组中HT-15/DDP细胞miR-10b-5p表达水平明显低于对照组，TGFBR2表达水平明显高于对照组(P<0.01),随着当归多糖剂量的增加，miR-10b-5p表达水平逐渐降低，TGFBR2表达水平逐渐升高，见表3、图1。

2.4 miR-10b-5p调控HT-15/DDP细胞TGFBR2的表达

使用生物信息学数据库(TargetScan、miRanda)预测miR-10b-5p的靶基因，结果显示，TGFBR2是miR-10b-5p的候选靶基因；Western blot检测结果显示，miR-10b-5p表达下调后，HT-15/DDP细胞中TGFBR2相对表达量明显高于对照组(miR-10b-5p正常表达)(t=19.257,P<0.001),见图2。

表2当归多糖对HT-15细胞、HT-15/DDP细胞凋亡的影响

表3当归多糖对HT-15/DDP细胞miR-10b-5p、TGFBR2表达的影响

图1各组HT-15/DDP细胞TGFBR2蛋白表达的Western blot电泳 

图2两组HT-15/DDP细胞TGFBR2蛋白表达的Western blot电泳  

2.5当归多糖通过miR-10b-5p/TGFBR2信号通路调控HT-15/DDP细胞的增殖、迁移、凋亡

HT-15/DDP细胞分别转染miR-10b-5p inhibitor、TGFBR2 mimics后，再经2.0 mg/mL当归多糖干预48 h,检测结果显示，当归多糖(2.0 mg/mL)+miR-10b-5p inhibitor组、当归多糖(2.0 mg/mL)+TGFBR2 mimics组HT-15/DDP细胞增殖率、细胞增殖迁移个数明显低于当归多糖组(2.0 mg/mL),HT-15/DDP细胞凋亡率明显高于当归多糖组(2.0 mg/mL)(P<0.05),见表4。

表4各组HT-15/DDP细胞增殖、迁移、凋亡情况

3、讨 论

结直肠癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，每年超过70万患者死于结直肠癌[4]。我国结直肠癌的流行病学趋势呈现出发病率上升、发病年龄提前、男性多见、直肠癌占比较高等特点，一半左右患者发生于直肠，其次是乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠、横结肠[5]。目前，临床治疗结直肠癌的手段主要有手术切除、放疗、化疗等，其中化疗药物选择多为铂类药物、奥沙利铂、卡培他滨、伊立替康等，患者对铂类化疗药物产生耐受性是不良预后的主要原因[6]。探究结直肠癌铂类化疗药物耐受性产生的相关机制及能够缓解耐药性相关基因的关键分子及药物，对改善预后具有重要意义。相关研究[7]显示，当归可用于恶性肿瘤患者后期辅助治疗，其中当归多糖的抗癌活性是目前研究的热点之一，其具有抗氧化、促进免疫应答、抑制肿瘤细胞生长等多种活性，能够通过多种分子机制抑制肝癌细胞、胃癌细胞的增殖、转移和迁移[8]。但关于当归多糖在逆转结直肠癌顺铂耐药中的作用效果及相关机制的研究仍十分少见。

本研究结果显示，单独顺铂干预的对照组HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显高于HT-15细胞，HT-15/DDP细胞凋亡率明显低于HT-15细胞(P<0.01);经不同质量浓度当归多糖预处理12 h后，明显增强了HT-15/DDP细胞对顺铂的敏感性，HT-15/DDP细胞增殖率、细胞迁移个数明显降低，凋亡率明显升高(P<0.01),提示当归多糖能够有效抑制结直肠癌细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用；与铂类化疗药物敏感的结直肠癌HT-15细胞相比，耐药的HT-15/DDP细胞对顺铂的治疗效果明显下降，当归多糖能够有效逆转HT-15/DDP细胞对顺铂的耐药性。近年来的研究[9,10,11]显示，miRNA参与调控胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生与发展，其中miR-10b-5p是胰腺癌治疗的潜在靶基因，还能够调控乳腺癌细胞对放疗的敏感性[12,13];但miR-10b-5p在结直肠癌中的作用研究较少。本研究结果显示，不同剂量当归多糖组中HT-15/DDP细胞miR-10b-5p表达水平明显低于对照组，随着当归多糖剂量的增加，miR-10b-5p表达水平逐渐降低(P<0.05),提示当归多糖可能通过下调miR-10b-5p表达逆转HT-15/DDP细胞对顺铂的耐药性。

通过生物信息学数据库预测miR-10b-5p的靶基因，结果显示，TGFBR2是miR-10b-5p的候选靶基因。TGFBR2是转化生长因子β1信号通路的重要成分，参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等过程[14]。相关研究[15]显示，TGFBR2异常表达与乳腺癌耐药性的产生密切相关。本研究结果显示，不同剂量当归多糖组中HT-15/DDP细胞TGFBR2表达水平明显高于对照组(P<0.05),随着当归多糖剂量的增加TGFBR2表达水平逐渐升高。miR-10b-5p表达下调后HT-15/DDP细胞中TGFBR2相对表达量明显高于对照组(P<0.05),提示当归多糖可能通过上调TGFBR2表达逆转HT-15/DDP细胞对顺铂的耐药性；此外miR-10b-5p表达下调能够上调HT-15/DDP细胞中TGFBR2表达。HT-15/DDP细胞分别转染miR-10b-5p inhibitor、TGFBR2 mimics后再经2.0 mg/mL当归多糖干预48 h,可有效降低HT-15/DDP细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡，证实了当归多糖可通过miR-10b-5p/TGFBR2信号通路调控HT-15/DDP细胞的增殖、迁移和凋亡，进而逆转结直肠癌细胞顺铂耐药性。

综上所述，当归多糖可通过下调miR-10b-5p表达、上调TGFBR2表达逆转结直肠癌细胞顺铂耐药性，进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡，当归多糖具有成为结直肠癌铂类化疗方案辅助用药的潜力。

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基金资助:上海市卫健委卫生行业临床研究基金项目(202040436);

文章来源:杨柳,彭飞,陆平,等.当归多糖对结直肠癌细胞顺铂耐药性的影响及作用机制[J].北华大学学报(自然科学版),2024,25(04):448-453.