中药饮片是我国中医临床中较为常用的用药形式。近年来,由于防治新冠疫情之需,中药饮片行业也随之蓬勃发展。目前,在我国的中药饮片抽检过程中,仍然发现有大量不合格中药饮片流入市场[1]。中药饮片的质量直接关系着临床治疗的有效性。饮片的质量又与其有效成分的含量息息相关。基于课题组前期研究[2],本实验以常用中药白芍(Paeoniae RadixAlba)为例,通过参考2020版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)及有关文献,并结合现实情况,主要选择了与抗炎、抗氧化、镇痛、补血、抗溃疡、抗癌等药理作用相关的5种成分作为指标性成分,利用文献记载中最常用的高效液相色谱(HPLC)法[3,4,5,6,7],分别测定了自河北省安国药材市场采购的16批不同规格的白芍中5种成分的含量,并对其进行了比较,现报道如下。

1、材料与方法

1.1仪器与材料

1.1.1仪器

小型高速粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司);分样筛(上海言锦丝网加工厂);千分之一分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];万分之一分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];KQ-600B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Waters2695高效液相色谱仪(美国沃特斯公司);Milli-QReference超纯水机(美国Millipore公司);有机系滤膜(常德比克曼生物科技有限公司)。

1.1.2试药

乙腈、甲醇(PorMee)、甲酸(罗恩试剂)均为色谱级,水为超纯水。其他化学试剂均为分析级。5个对照品:没食子酸(批号:AF20050701);氧化芍药苷(批号:AF21021504);芍药内酯苷(批号:AF20041801);芍药苷(批号:AF20070752);1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(批号:AF20050111)均购买于成都埃法生物科技有限公司。16批白芍饮片均来自于河北安国药材市场,如图1所示。以“产地+规格+售价”编号,编号说明:“亳”表示产自亳州,“杭”表示产自杭州;“陈”表示陈货,“新”表示新货;带“选”字表示各类选片,带“统”字表示各类统片;数字表示售价。

1.2色谱条件

色谱柱为Welchrom C18柱(250mm×4.6mm,5μ洗m);流动相组成为(脱A)乙腈-(B)0.1%甲酸水;梯度,洗脱梯度:0～相8min,5%～12%A相;8～12min,12%～15%A;,相1设5置%为～双30波%长A。流速设置为121mL/min;检～3测0波min长235nm/270nm;柱温设置为30℃;进样量为10μL。在上述条件下5种成分分离度良好,分离度>1.5,如图2(235nm)、图3(270nm)所示。

图1 16批白芍饮片各取10g在同一条件下拍摄  

图2 235nm下的HPLC色谱  

图3 270nm下的HPLC色谱  

1.3对照品溶液制备

分别精密称取5种对照品:没食子酸5.75mg、氧化芍药苷6.28mg、芍药内酯苷6.23mg、芍药苷6.00mg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖6.60mg,加甲醇超声溶解制成对照品储备液。精密吸取5种对照品储备液适量于容量瓶中,用甲醇定量。最终得到含有上述5种成分的混合对照品溶液,浓度分别为115.0μg/m L、125.6μg/m L、249.2μg/m L、480.0μg/m L和264.0μg/m L,4℃下保存。

1.4供试品溶液制备

用粉碎机将白芍粉碎,过60目筛。精密称取0.10g中粉,置小烧杯中,加入适量75%甲醇,超声提取20min。过滤,将滤液转入10m L容量瓶中,静置放冷,定容后摇匀。过0.22μm微孔滤膜,取续滤液,作为供试品溶液。

2、实验与结果

2.1方法学考察

2.1.1线性范围考察

精密吸取上述制备好的混合品对照品溶液于容量瓶中,采取对半稀释的方法以得到不同浓度的对照品混合液,根据实际情况决定稀释次数。在“1.2”项色谱条件下进行测定,将所得到的结果以浓度(C,μg/m L)为横坐标(X),对应测得的峰面积(A,微伏×秒)为纵坐标(Y),绘制标准曲线,计算回归方程,结果见表1。 

表1 5种成分的线性回归方程  

2.1.2精密度实验

取样品“选精38”进行精密度考察。日内精密度:按“1.2”项下的色谱条件进样,1d内连续进样6次,每次10μL,记录峰面积。日间精密度:连续3d,按同样的方法测定,记录峰面积。计算所得结果,上述5种成分含量的RSD均<3.0%,说明仪器的精密度良好。

2.1.3重复性试验

平行取编号“选精38”的白芍饮片粉末6份按照“1.4”项下描述的方法制备供试品溶液,并进行含量测定。最终测得没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的平均百分含量分别为0.131%、0.012%、0.436%、2.585%、0.311%,RSD分别为2.8%、1.6%、1.2%、1.3%、2.0%。

2.1.4稳定性试验

取“杭新统40”白芍饮片按照“1.4”项下描述的方法制备供试品溶液,分别于0、6、12、18和24h进行测定,考察该方法的稳定性,计算没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为2.7%、1.7%、1.0%、1.0%、2.5%,结果表明,在24h内供试品溶液各成分稳定,该方法稳定性良好。

2.1.5加样回收率

精密称取“杭新统40”样品粉末6份,已测得该样品中上述5种成分的含量。在每一份新称取的供试品中均加入100%该样品含量的5种成分对照品,再分别按“1.4”项下描述的方法制备供试品溶液。进样测定,记录峰面积,计算平均加样回收率。得到没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的平均加样回收率分别为100.95.%、100.25%、100.25%、97.91%、97.26%,RSD分别为1.7%、2.4%、2.4%、2.6%、2.1%。

2.2样品测定

依次取图1所示16批次不同规格的白芍样品,按照“1.4供试品溶液制备”项下所描述的方法进行测定。仪器测定所得的数据根据“2.1.1线性范围考察”项下回归方程进行计算,最终得到的定量检测结果见表2。

表2 16批不同规格的白芍饮片中5种成分的百分含量 

3、分析与讨论

3.1中药市场良莠不齐,产业下游管控不严

首先,根据《中国药典》对白芍饮片的含量测定要求,芍药苷的含量不能少于1.2%[8]。本实验中(见表2)除“杭选陈50”“杭统陈38”两批陈货外,其他批次的新鲜饮片均达到了《中国药典》规定。其次,将本实验中不同价位的“亳统”片进行比较,会发现并非价格越高饮片中活性成分含量越多。再如,“亳中选”(1)和(2),同样的规格和售价,饮片性状差异却十分显著(如图1)。

白芍虽是著名的“浙八味”之一,但以亳白芍产量最大。在购买饮片时也发现,市场上流通更广的其实是亳白芍,规格多样、可选择性强,其价格也较杭白芍便宜。川白芍则较少见,在一些中药材互联网市场能找到它的身影。在现实情况中,销售时分类多以“杭(亳)白芍统货”“杭(亳)白芍精选(选片)”,或者“杭(亳)白芍大片(中片、小片)”等来划分,甚至标注同样规格的饮片价格也不等,在选购时就足以使人眼花缭乱。

据文献记载,中华人民共和国成立前中药饮片是根据质量分档次定价,以此来满足不同阶层的需要。如今随着社会发展,“统货统价”的政策逐渐覆盖市场。而且,现有的检测标准缺少对饮片质量的等级区分,导致市场上的饮片不分等级和质量好坏,全部混合统装[9]。定价则多依据鱼目混珠的外观和产地,缺少客观评价指标,使得市场定价混乱,给消费者造成极大困扰。

医院等医疗机构是中药饮片企业下游连接的主要对象,多采用公开招标、低价中标的模式购入饮片。中药饮片是由中药材按照一定的方法进行加工炮制所得,工序复杂也易于造假。多数情况下,采购人员对中药饮片仅通过手摸、眼观、口尝等传统方式判定其质量优劣,缺乏现代科学技术的支撑。此外,医院对饮片的质量控制方法则主要包括规范购货渠道、严格入库验收流程、提高养护水平等,并未从根本上对其有效性进行把控[10]。

中药市场竞争激烈,药品质量与经济利益直接相关,因此出现较多以陈充新、以次充好、以假乱真的现象。很多时候,经验评价方法并不能准确评判饮片质量的优劣。在如此的市场及产业链中,规范生产的饮片企业在价格上并无竞争优势。这种现象已严重影响中药产业健康可持续发展,成为制约中药产业发展的瓶颈[11]。

3.2质量影响因素多样,评价标准落后单一

比较本实验所采购的亳白芍和杭白芍中5种成分含量发现,杭白芍作为道地药材,其《中国药典》规定的唯一测定成分———芍药苷的含量甚至较亳白芍低,而其氧化芍药苷和芍药内酯苷的含量相对较高。在传统经验中,判断白芍质量时,以根粗长、匀直、质坚实、粉性足、表面洁净者为佳。例如,将“亳精选38”“亳选38”与“亳选37”相互比较,首先三者芍药苷含量均符合《中国药典》规定,且差异不大。对比饮片性状(图1)发现,三者中“亳选37”质量最重,“亳精选38”略轻但饮片大小均一,表面更洁净。结合所测得的活性成分含量看,“亳选37”饮片中5种成分的含量最多,“亳精选38”与之相差不大。而“亳选38”与两者比较,单帖苷类的含量差异不大,但没食子酸及其衍生物的含量差异却达到2倍以上。

文献表明,目前分析白芍所采用的方法有很多种,而HPLC法因其分离效率高、选择性好、灵敏度高、操作自动化,已广泛应用于白芍的含量测定和质量控制[7]。因此,笔者选择HPLC方法进行本次实验。白芍中化学成分丰富,现代研究表明,其具有抗炎、提高免疫功能、抗溃疡、抗菌消炎等药理作用。单萜及其苷类化合物是白芍中主要的活性成分,其中芍药苷含量最高[3],2020版《中国药典》中也是以其作为质量检测的唯一指标性成分。但有研究认为,鞣质类成分也是白芍中最主要的生物活性成分之一,在评价白芍及其相关产物时,鞣质常被忽略[12]。其中,没食子酸及其衍生物具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生理功能[13],并在炮制方法对白芍化学成分影响的研究中发现,没食子酸和五没食子酰基葡萄糖的含量在经过去皮和水煮的炮制处理后均有所增加[14]。

中药饮片的质控标准是保障饮片临床使用有效性的重要指标,尽管《中国药典》对许多饮片的质量标准进行了统一规定,但在实际应用中,中药饮片的检验方法和质量控制指标目前仍滞后且不全面。中药是多组分、多靶点及其组分间协同作用的复杂体系,仅对单一成分的含量进行检测并不能从整体水平把控饮片的质量。研究表明,饮片的种质和产地、采收时间、产地加工、炮制工艺等因素均会对饮片的质量产生影响,尤其在炮制过程中会引起各类成分的改变,在临床实际应用中会产生治疗效果的差异[15]。

3.3推进中药标准化,保证有效安全性

中药标准化是中药现代化、国际化的需要,而中药质量的保证是中药功效稳定发挥及安全应用的重要前提。因此,对中药质量评价体系进行规范化和标准化管理,才有可能实现中药现代化和国际化。在中药质量评价发展中,早期大多凭借自身经验,通过中药性状对其进行传统经验鉴别。随着光谱、色谱技术日益普及,中药质量控制模式开始借鉴化学药物的质控方法,逐步发展为可量化的指标成分分析,目前的质量标准多采用两者相结合的方式评价中药质量[16]。随着研究深入,人们逐步认识到中药成分复杂多样。近年来,围绕中药质量控制和评价体系建设及模式创新日益增多,也取得了众多突破性成果,例如,提出了中药整合质量观、中药质量标志物等新概念,引领了中药质量控制发展的新方向。同时也涌现出了一系列中药质量评价创新技术与创新方法,值得深入研究和临床运用参考[17]。

在实际用药过程中,除中药饮片质量的基础研究外,制定统一的炮制标准,以及对中药饮片的生产、流通和使用等环节实施有效的质量管理均是推进中药标准化的重要举措[18]。中药饮片标准体系构建与完善,可借鉴近年来对同源药材的研究成果,并引入高效可靠的现代分析技术手段,探究其药效物质基础及作用机制。还应对炮制原理深入剖析,探索多指标成分测定,进一步提高质量控制指标的科学性及专属性,建立如一测多评等适合饮片特点,且符合中药饮片疗效的多指标质量评价模式方法[19,20]。饮片质量评价标准研究可为饮片规格分级、实现优质优价提供技术支撑;饮片分级标准制定、优质优价政策推进将为临床合理用药提供科学依据。如此才能既确保中药饮片临床疗效,还可极大加快中药饮片产业发展[9]。医疗机构是中药饮片的主要应用部门,其不仅应跟进饮片质量控制管理,也需对其采购方式进行相应调整,增加对饮片质量因素的考量,鼓励不同等级饮片供应,逐步实现优质优价[21]。

4、结语

近年来,中药标准化项目正在不断推进,但中药市场发展仍存在诸多制约因素。还需积极促进中医药传承创新发展,广泛听取相关意见建议,改善市场环境,实现良性循环。将便捷准确的现代分析技术引入中药饮片质量评价中,建立起标准的操作规范和完整的质量评价体系,加强中药质量监管,保障用药安全和有效。

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基金资助:河北省财政厅课题(2019061444);河北中医学院科研能力提升项目(KTY2019024);河北省药学会“晴冀药学”医院药学专项科研面上课题(2022-Hbsyxhqjyxms20);

文章来源:何倩倩,刘旭,孙笑奇等.基于白芍饮片含量测定探讨临床用药质量控制[J].亚太传统医药,2024,20(02):35-39.