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HBV感染患者外周血ISGs表达水平变化及其与干扰素治疗疗效关系

2024-07-15 13 上传者：管理员

摘要：目的探讨HBV感染患者外周血干扰素刺激基因（ISGs）表达水平变化及其与干扰素治疗疗效的关系。方法选取首都医科大学大兴教学医院2018年4月至2023年5月收治的80例HBV感染患者纳入HBV组，另选取同期进行健康体检者80例作为对照组。对比两组外周血黏病毒抗性蛋白A(MxA)m RNA、泛素特异性蛋白酶18(USP18)m RNA、细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)m RNA表达水平，HBV组患者均给予重组人干扰素α-2b持续治疗24周，依照干扰素应答情况，分为干扰素应答组（n=38）与干扰素无应答组（n=42）两个亚组，通过Logistic回归分析外周血指标与干扰素应答的关系，并观察HBV组患者干扰素治疗前后MxAm RNA、USP18m RNA、SOCS3 mRNA水平变化。结果 HBV组治疗前外周血MxA mRNA水平低于对照组，USP18m RNA、SOCS3 mRNA水平高于对照组（P<0.05）；干扰素应答组治疗前外周血MxA mRNA水平高于干扰素无应答组，USP18 mRNA、SOCS3 mRNA水平低于干扰素无应答组（P<0.05）;Logistic回归分析显示USP18 mRNA、SOCS3 mRNA高表达是HBV感染患者干扰素无应答危险因素，MxA m RNA高表达是干扰素应答保护因素；干扰素应答组治疗前、治疗2周、12周、24周后外周血MxA m RNA表达水平高于干扰素无应答组，USP18 mRNA、SOCS3 mRNA表达水平低于干扰素无应答组（P<0.05）。结论 HBV感染者应用干扰素治疗中，MxA高表达、USP18、SOCS3低表达者具有较佳的干扰素应答疗效。

关键词：
HBs Ag
乙型肝炎病毒
干扰素
干扰素刺激基因
治疗应答
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据统计，全球慢性乙型肝炎感染人数已超3.5亿人，且感染群体中有75%的人于亚太地区生活[1]。对于HBV感染患者来说，给予一系列抗HBV治疗是必不可少的[2]。临床上慢性乙型肝炎治疗的最终目的在于有效清除HBs Ag，实现血清学转化，干扰素在HBs Ag清除方面优势明显[3]。我国应用干扰素治疗的乙型肝炎患者中，约40%～50%实现干扰素应答，病情控制有效，预后明显改善，然而也有部分患者无法获得应答[4]。干扰素通过JAK信号转导与转录激活因子（STAT）信号通路激活，诱导大量干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISGs）转录[5]。ISGs表达蛋白可直接抑制HBV复制，反馈调节干扰素表达，抑制病毒入侵、释放[6]。本研究通过探讨HBV感染患者外周血单核细胞中黏病毒抗性蛋白A(Myxovirusresistanceprotein A,Mx A)m RNA、泛素特异性蛋白酶18(Ubiquitin-specific protease 18,USP18)m RNA、细胞因子信号转导抑制因子3(Monoclonal Antibody to Suppressors of Cytokine Signaling 3,SOCS3)m RNA表达水平与干扰素治疗效果之间的关联，旨在为临床治疗提供参考。

1、资料与方法

1.一般资料：

选取首都医科大学大兴教学医院2018年4月至2023年5月收治的80例慢性HBV感染患者，其中男44例，女36例，年龄30～75(53.97±9.68）岁。另选取同期健康体检者80例作为对照组，其中男42例，女38例；年龄31～77(54.38±9.15）岁。

纳入标准：（1）符合慢性乙型肝炎诊断[7],HBs Ag阳性3个月以上，HBV-DNA≥1×105 copies/m L，血清丙氨酸转氨酶≥60 U/L，天冬氨酸转氨酶≥60 U/L;(2）合并或未合并肝硬化，肝硬化处于代偿期；（3）年龄≥18岁；（4）经医院伦理委员会批准通过，患者及家属知情同意。排除标准：（1）合并其他慢性疾病史、长期饮酒史；（2）合并人类免疫缺陷病毒、甲型、丙型、戊型肝炎等其他病毒感染；（3）合并自身免疫性疾病；（4）存在感染、外伤等应激反应状态；（5）妊娠或备孕妇女或哺乳期妇女；（6）应用其它抗病毒药物治疗；（7）应用免疫抑制剂治疗。

2.治疗方案：

HBV组患者采用重组人干扰素α-2b（安徽安科生物工程股份有限公司，国药准字S20020103）治疗，500万IU，肌肉注射，1次/d，持续治疗24周。

3.HBV检测：

于治疗前后对HBV组患者进行HBV病毒标志物检测，通过酶联免疫吸附法，试剂盒来自上海实业科华生物，严格按说明书操作。采用罗氏Light Cycler 480实时荧光定量PCR系统检测血清HBV DNA水平。

4.外周血ISGs基因表达水平检测：

对照组于体检时，HBV组于治疗前、治疗2周、12周、24周后，取5 m L新鲜外周血，离心管中加入分离液5 m L，血液平铺在分离液上方，界面保持清晰。外周血单核细胞分离（密度梯度离心法），细胞浓度调整到1×106/m L，接种（24孔板），培养4 h，洗脱，置5%的CO2培养箱（37℃，24 h），得到细胞。细胞总RNA提取（Trizol试剂），去除基因组DNA(Vazyme试剂盒），逆转录，合成c DNA。实时荧光定量PCR法测定USP18 m RNA、Mx m RNA、SOCS3 m RNA水平。扩增反应体系：2×SYBR Green Master Mix(5μL）、引物（上下游引物各0.5μL）、逆转录产物（2.5μL）、dd H2O(1.5μL）。93℃预变性2 min→93℃变性15 s→63℃退火15s→74℃延伸30 s，共40个循环。引物序列见表1,2-△△Ct计算相对表达量。

表1引物序列

5.疗效判定标准：

治疗后24周对HBV患者进行干扰素疗效判定。干扰素应答：肝功能恢复；HBV DNA载量下降2个log10copies/m L及以上；HBe Ag滴度下降。干扰素无应答：肝功能未恢复；HBV DNA载量下降程度达不到应答标准；HBe Ag未阴转或滴度未下降[8]。

6.统计学方法：

采用SPSS 21.0软件，计量资料组间不同时间点比较采用重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，计数资料组间采用卡方检验比较，采用Logistic回归分析干扰素治疗应答影响因素，P<0.05代表差异有统计学意义。

2、结果

1.外周血ISGs基因表达水平：

HBV组治疗前外周血Mx A m RNA水平低于对照组，USP18 m RNA、SOCS3 m RNA水平高于对照组（P<0.05）。见表2。

表2 HBV组与对照组外周血ISGs基因表达水平（±s)

2.不同临床特征HBV患者干扰素应答情况比较：

不同性别、年龄、肝硬化状态HBV患者干扰素应答情况比较（P>0.05）；干扰素应答组与干扰素无应答组治疗前ALT水平、治疗前HBV DNA水平比较（P>0.05）。见表3。

3.外周血ISGs基因表达水平比较：

干扰素应答组治疗前外周血Mx A m RNA水平高于干扰素无应答组，USP18 m RNA、SOCS3 m RNA水平低于干扰素无应答组（P<0.05）。见表4。

4.HBV感染患者干扰素应答影响因素Logistic回归分析：

以干扰素应答情况作为因变量，以Mx A m RNA、USP18 m RNA、SOCS3 m RNA作为自变量（α=0.05），采用Logistic回归法进行分析，将Mx A m RNA、USP18 m RNA、SOCS3m RNA纳入回归方程，结果显示USP18 m RNA、SOCS3 m RNA高表达是HBV感染患者干扰素无应答危险因素，Mx A m RNA高表达是干扰素应答保护因素。见表5。

5.HBV感染患者治疗前后外周血ISGs基因表达水平变化：

两组治疗后Mx A m RNA水平低于治疗前，USP18 m RNA、SOCS3 m RNA水平高于治疗前，且干扰素应答组治疗前、治疗2周后、治疗12周后、治疗24周后外周血单个核细胞Mx A m RNA表达水平高于干扰素无应答组，USP18 m RNA、SOCS3 m RNA表达水平低于干扰素无应答组（P<0.05）。见表6。

表3不同临床特征HBV患者干扰素应答情况比较

表4干扰素应答组与干扰素无应答组治疗前ISGs基因表达水平比较（±s)

表5 HBV染患者干扰素应答影响因素分析

表6干扰素应答组与干扰素无应答组患者治疗前后ISGs基因表达水平变化（±s)

3、讨论

HBV持续复制是乙型肝炎病情进展重要原因，干扰素具抗病毒与免疫调节双重作用，耐药率低[9]。然而不同患者干扰素治疗疗效存在一定的差异，部分患者临床上干扰素治疗存在无应答[10]。ISGs可发挥多重生物学效应，一方面干扰素可诱导ISGs生成，有效抑制病毒入胞、病毒转录和复制、病毒出胞，于病毒生命周期各个阶段发挥其抗病毒功效；另一方面ISGs还可调控干扰素诱导的免疫应答，增强机体对病原体的识别能力[11]。

Mx是一种鸟苷三磷酸酶，由Mx A和Mx B基因编码，但只有Mx A蛋白可通过病毒复制周期阻断实现抗病毒目的，Mx A蛋白识别病毒核糖核蛋白复合物，导致构象改变，实现Mx A蛋白活化，对病毒产生水解作用，释放出病毒核酸，并被核酸酶降解[12]。本研究中HBV组外周血Mx A m RNA表达水平低于对照组，HBV核心蛋白可以直接结合Mx A启动子从而抑制Mx A蛋白转录。本研究中干扰素应答组患者外周血单个核细胞Mx A m RNA水平高于干扰素无应答组患者，与Millrain等[13]研究结果一致，与此同时本研究显示治疗前Mx A m RNA高表达是干扰素应答保护因素，Mx A m RNA高表达状态下，STAT1磷酸化增加，促进Jak/STAT通路激活，在一定程度上促进干扰素应答。

USP18是泛素特异性蛋白酶家族成员，基因转录启动子位于干扰素刺激应答反应元件中，诱发机体强烈表达USP18蛋白[14]。Gruber等[15]研究通过高通量基因芯片检测技术对干扰素治疗无效和治疗有效的丙型肝炎病毒感染者基因表达分析发现，治疗无效患者肝组织USP18高表达，且USP18表达增加是干扰素治疗无效预测因子。本研究中干扰素应答组患者外周血单个核细胞USP18 m RNA水平低于干扰素无应答组患者，与上述研究结果一致，USP18 m RNA水平高表达是干扰素无应答危险因素之一，一方面USP18能特异性移除并水解干扰素刺激基因15；另一方面USP18可通过和干扰素α和β受体亚基2结合，抑制其与蛋白质酪氨酸激酶JAK-1结合，抑制干扰素诱导的Jak-STAT信号通路，在一定程度上抑制干扰素应答[16]。

Lee等[17]研究显示SOCS3在JAK-STAT途径中发挥负性调控作用，可通过抑制JAK-STAT信号途径减少抗病毒蛋白生成，降低干扰素抗病毒功能。SOCS3基因分为三个部分，包括氨基端激酶抑制区（KIR）、中间SH2区、羧基端SOCS盒，且主要依赖KIR及SH2区发挥作用，JAK-STAT信号通路可调控SOCS3m RNA表达，诱导SOCS3蛋白生成[18]。本研究中与干扰素应答组患者相比，干扰素无应答组患者SOCS3 m RNA表达水平较高，SOCS3 m RNA水平高表达是干扰素无应答危险因素之一。SOCS3的SH2区和STAT具有类似结构，从而可模拟STAT，通过竞争关系妨碍JAK和受体的结合，阻碍STAT活化；SOCS3的KIR区可与JAK结合，抑制JAK激酶活性；SOCS盒则可降解将与之结合的JAK、STAT蛋白，从而抑制JAK-STAT信号通路[19]。

本研究中治疗2周时，相较于治疗前，患者外周血Mx Am RNA表达水平明显降低，USP18 m RNA、SOCS3 m RNA表达水平明显升高，且无应答组患者降低或升高趋势更为显著，这种差异一直维持至治疗24周。然而患者在治疗2周、12周及24周时外周血Mx Am RNA、USP18 m RNA、SOCS3 m RNA表达水平无明显差异，不会因干扰素持续性累积而改变，这可能是由于细胞表面分布的干扰素受体有限，IFN-α持续性刺激可能导致受体疲劳。本研究的不足之处在于未对沉默的ISGs基因是否丧失了其抗病毒作用和IFN抗病毒活性增强作用，后续可进一步研究。

综上，HBV感染者应用干扰素治疗中，Mx A高表达、USP18、SOCS3低表达者具有较佳的干扰素应答疗效。

参考文献:

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[14]张小梅,雷青松,秦波,等.泛素特异性蛋白酶18抑制IFNα抗HBV活性但并不抑制IFNλ抗HBV的活性[J].中国生物化学与分子生物学报, 2018, 34(9):954-961.

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[19]钟瑞雪,谢伟贤,黄泽棋,等.干扰素刺激基因表达对Peg-IFN抗乙型肝炎病毒免疫应答的影响[J].基因组学与应用生物学, 2019,38(1):478-483.

文章来源:胡静,杨秀锦,侯志云.HBV感染患者外周血ISGs表达水平变化及其与干扰素治疗疗效的关系[J].中华消化病与影像杂志(电子版),2024,14(04):343-347.