前列腺癌是威胁老年男性健康与寿命的重大疾病，在全球范围内，前列腺癌约占所有男性恶性肿瘤的13.5%，位居第2位[1,2]。在我国超过2/3的患者确诊时已经是晚期，是我国男性泌尿生殖系统中发病趋势和致死趋势最高的肿瘤[3]。传统中草药及其药效成分具有多通路、多靶点的独特优势，在控制前列腺癌发展和提高患者生活质量方面起到重要的作用[4,5]。芹菜素作为一种广泛存在于植物中的天然黄酮类小分子，在降糖[6,7]、抗炎[8]、免疫调节[9]、神经保护[10]和抗肿瘤[11]方面表现出广泛且良好的药效。最新的多项研究成果证明芹菜素在细胞和动物实验中表现出对前列腺癌细胞和组织有良好的抑制作用[12,13,14]，但其详细的分子作用机制尚未完全阐明。本研究通过TCGA和GEO数据库前列腺癌患者的测序样本开展生物信息学分析，联合网络药理学[15]和分子对接技术系统性地探索了芹菜素抗前列腺癌潜在的分子机制，为其研究与研发提供理论基础与证据。

1、材料与方法

1.1芹菜素药物作用靶点获取

利用ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM）、HERB数据库（http://herb.ac.cn）和HIT 2.0数据库（http://hit2.badd-cao.net/）以“apigenin”为关键词检索芹菜素的药物作用靶点。从Pub Chem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索芹菜素“SDF”格式2D结构式，并将其输入Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测药物作用靶点，限定物种为“homo sapiens”，设置条件“probability>0”。结合Uni Prot蛋白质数据库（https://www.uniprot.org），限定物种为“human”，将蛋白靶点转换为对应的基因名，基因名以官方名称为标准。汇总芹菜素药物作用靶点，删除重复值并剔除无对应靶点的数据。

1.2前列腺癌疾病靶点筛选

从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载TCGA-PRAD数据集转录组数据，其中包括378例前列腺癌组织和46例正常组织。从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载GSE46602数据集[16]数据，其中包含了40例前列腺癌组织和14例正常组织。借助R软件“limma”包对数据进行差异分析，差异基因筛选标准设置为P<0.01且|lg2FC|>1，差异分析结果以火山图和热图形式展示。此外，以“prostate cancer”为关键词，分别在OMIM数据库（https://omim.org/）和Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）检索前列腺癌相关疾病靶点，最后将差异基因和数据库靶点合并去重作为前列腺癌的疾病靶点。

1.3“活性成分–交集靶点”网络构建

将芹菜素药物作用靶点和前列腺癌疾病靶点数据导入Venny 2.1数据库在线平台（http://www.ehbio.com/test/venn/）得到交集靶点，即为芹菜素抗前列腺癌作用靶点。将“芹菜素”和“芹菜素抗前列腺癌作用靶点”导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“活性成分–交集靶点”网络图。

1.4交集靶点蛋白质相互作用（PPI）网络构建与核心靶点筛选

将芹菜素抗前列腺癌作用靶点导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/），物种选择“homo sapiens”，其余条件按默认设置，将获得蛋白质相互作用关系数据导入Cytoscape 3.9.1软件，构建PPI网络图。利用Clusterviz插件筛选核心作用靶点并绘制核心作用靶点网络图。按degree大小设置蛋白质图标大小和颜色深浅，直观反映该蛋白在PPI网络中的重要性。

1.5基因本体（GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将芹菜素与前列腺癌的交集靶点导入到Metascape数据库（http://metascape.org），设定物种为“homo sapiens”，以P≤0.05为筛选条件，进行GO功能和KEGG富集分析。将富集分析结果上传至生物信息学云平台（http://www.bioinformatics.com.cn/），以P值和数量为参数绘制气泡图。

1.6分子对接

上述PPI网络中与其他基因、活性成分和通路均有良好相关性的核心靶点，在查阅文献[17,18,19]后筛选保留6个密切度高的核心蛋白进行分子对接。利用Pub Chem数据库下载核心靶点蛋白的2D结构，利用Open Babel 2.3.2软件将SDF文件转成PDB文件。在PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb）检索核心靶点蛋白的晶体结构，使用Py MOL 2.3.4软件对受体蛋白进行去水和去配体操作，利用Auto Dock Tools软件完成加氢等操作，分别将受体蛋白和配体小分子转化为pdbqt格式，应用软件Auto Dock Vina1.1.2开展分子对接操作，选取结合能最小的构象作为分子对接结果。一般来说结合能小于-5.0kcal/mol(1 cal=4.2 J）被认为具有良好的结合潜力，运用Py-MOL软件将分子对接结果进行可视化。

2、结果

2.1芹菜素药物作用靶点获取

利用ERCM、HERB、HIT2.0和Swisstarget Prediction数据库获取芹菜素的药物作用靶点，并通过Uniprot数据库将芹菜素药物作用靶点蛋白名转化为官方基因名，合并且删除重复项后获得芹菜素潜在的药物作用靶点259个。

2.2前列腺癌疾病靶点筛选与检索

Limma差异分析结果显示，TCGA-PRAD数据集共得到564个差异基因，包括431个上调基因和133个下调基因（图1A），而GSE46602数据集共得1 232个差异基因，包括466个上调基因和766个下调基因（图1B）。OMIM数据库则挖掘得到496个前列腺癌相关靶点；Gene Cards数据库挖掘得到14 355个靶点，设置relevance score≥20为筛选标准，筛选获得靶点1 109个；4项合并去重后共得到3 253个前列腺癌疾病相关靶点。

图1 TCGA-PRAD数据集（A）、GEO数据库（B）差异基因分析结果 

2.3“活性成分–交集靶点”网络构建

将筛选所得芹菜素潜在药物作用靶点和前列腺癌疾病靶点导入Venny 2.1网站绘制韦恩图，获得交集靶点236个（图2）。应用Cytoscape 3.9.1软件构建“活性成分–交集靶点”网络图（图3）。表明芹菜素抗前列腺癌是基于多靶点的复杂协同作用。

2.4 PPI网络的构建与核心靶点分析

将236个芹菜素抗前列腺癌作用靶点输入STRING数据库中初步构建PPI网络并导出互作数据，借助Cytoscape 3.9.1软件进行芹菜素抗前列腺癌作用靶点的PPI网络图绘制（图4A）。除去2个游离的靶点，芹菜素抗前列腺癌作用靶点的PPI网络内分布234个节点和4 631条边，平均degree为0.64。在核心靶点分析时，借助Cystoscape 3.9.1软件所含classs Viz的MCODE算法进行分析，选取第1个平均degree最高的核心靶点蛋白交互关系结果，总共筛选出个70核心靶点，构建核心PPI网络（图4B）。芹菜素抗前列腺癌作用的核心靶点见表1。

图2芹菜素作用靶点与前列腺癌疾病靶点韦恩图  

图3“活性成分–交集靶点”网络

图4芹菜素抗前列腺癌作用靶点的PPI网络图（A）、核心作用靶点PPI网络图（B)   

表1核心靶点参数  

2.5富集分析结果

2.5.1 GO富集分析

图5 GO富集分析

通过Metascape数据库对236个芹菜素抗前列腺癌作用靶点进行GO功能富集分析，以P值大小选取生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF)3个项目排名前10位的数据进行可视化分析（图5）。

结果表明，芹菜素抗前列腺癌涉及多个BP，影响多种CC和MF，其中BP富集结果192项，主要涉及对激素的反应（response to hormone）、蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、细胞对脂质的反应（cellular response to lipid）、细胞死亡的正向调控（positive regulation of cell death）、激酶活性的调节（regulation of kinase activity);CC富集结果23项，主要涉及蛋白激酶复合物（protein kinase complex）、膜筏（membrane raft）、转录调节复合物（transcription regulator complex）和染色质区域（chromosomal region);MF富集结果37项，主要涉及蛋白激酶活性（protein kinase activity）、激酶结合（kinase binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、激酶调节器活性（kinase regulator activity）和细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）。

2.5.2 KEGG富集分析

在KEGG富集分析中共获得177条相关信号通路，按P值大小排序，选取排名前20位的通路进行数据可视化分析（图6）。其中，肿瘤信号通路（pathways in cancer）、NF-kappa B信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、Fox O信号通路（Fox O signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、肿瘤微小RNA(Micro RNAs in cancer）、癌症中的转录失调（transcriptional misregulation in cancer）等通路可能与芹菜素抗前列腺癌密切相关。

2.6分子对接

选取6个核心靶点蛋白与芹菜素进行分子对接。以结合能数值大小评价分子对接结果，结合能越小，说明配体与受体结合的能力越强。当结合能在-5 kcal/mol及以下的水平，表示配体和受体具备良好的结合活性；而当结合能小于-7 kcal/mol时，一般认为配体与受体结合的活性非常强。结果显示芹菜素与核心靶点蛋白的结合能在-10～-7.1kcal/mol，可见芹菜素与核心靶点蛋白之间的结合活性非常高（表2）。核心靶点蛋白与芹菜素对接分子对接模式图见图7。

图6 KEGG富集分析

表2芹菜素与核心靶蛋白分子对接结果

3、讨论

前列腺癌最常用的治疗方法包括前列腺根治手术、内分泌治疗和放射治疗等，但治疗引起的不良反应常常会造成病人尿失禁、性功能障碍以及直肠功能破坏，给患者造成极大的生命质量困扰[20,21,22]，探索药效和作用靶点明确的中药新药或许可以为前列腺癌的治疗提供新思路。多项研究报道了芹菜素抗前列腺癌的作用[23,24]，探索芹菜素抗前列腺癌作用靶点和通路调控机制，为下一步芹菜素药物开发和前列腺癌防治的临床应用提供依据。

本研究共挖掘出236个芹菜素抗前列腺癌作用靶点，说明芹菜素通过多靶点发挥抗前列腺癌作用。GO功能富集分析结果提示，芹菜素很可能通过调节前列腺癌细胞与激素反应、蛋白激酶活性调节、转录因子调控及细胞死亡正向调控等过程实现抗前列腺癌的作用。在KEGG通路富集分析中发现多条与前列腺癌密切相关信息通路，如p53信号通路[25]、NF-kappa B信号通路[26]、Fox O信号通路[27]、癌症中的微RNA[28]、癌症中的转录失调[29]，这些通路均与前列腺癌发生、凋亡和转移的调控密切相关，表明本研究所挖掘的芹菜素抗前列腺癌作用靶点具有一定的可靠性。

图7芹菜素与核心靶点蛋白分子对接 

为了进一步明确芹菜素抗前列腺癌的核心作用靶点，本研究在PPI网络的基础上筛选出70个核心作用靶点，结合已报道的研究结果，筛选出6个核心靶点进行分子对接。多数早期前列腺癌属于雄激素依赖性肿瘤，雄激素受体的调节成为抗肿瘤治疗的一大思路[30]。Bcl-2是雄激素非依赖性前列腺癌去势治疗后的重要靶分子，会增加晚期前列腺癌中对雄激素抵抗性[31]，而抑制Bcl-2的表达可增加前列腺癌细胞对药物的敏感性[32]。c-Jun单独作为雄激素受体的辅助因子，通过转录因子活化蛋白1(AP-1）的形成，进而激活不依赖于雄激素的雄激素调节基因[33]，抑制雄激素受体功能。HIF-1A在体外促进肿瘤增殖，在体内促进肿瘤生长。HIF1A在体内的稳定表达可以在缺乏内源性雄激素的情况下恢复肿瘤的生长[34]。TNF-α在血清中的水平与前列腺癌患者血清Gleason评分水平呈正相关[35]，在高转移性人前列腺癌细胞系PC-3中TNF-α能强诱导肿瘤促进因子LCN2 m RNA和蛋白表达[36]。在前列腺癌患者中，雄激素受体（AR）介导的前列腺细胞中ERG的过表达，并且过表达ERG的前列腺癌细胞活性受ERG调控[37]。ERG基因沉默后，细胞周期在G0/G1期出现阻滞，可以抑制前列腺细胞生长[38]。ESRRA编码的蛋白雌激素相关受体α(ERRα）是一类孤儿核受体，抑制ERRα活性可以减少前列腺癌细胞中DHT的产生并抑制AR信号转导[39]。并且ERRα的上调与前列腺癌中致癌转录因子ERG的表达密切相关，这样共表达模式的增加与患者的Gleason评分和肿瘤转移密切相关[40]。以上研究的报道证实这些核心靶点在前列腺癌的进展和防治中起到关键的作用，也证实了芹菜素抗前列腺癌的潜在价值。分子对接的结果也发现Bcl-2、JUN、HIF-1A、TNF、ERG和ESRRA与芹菜素有非常强的结合潜力，进一步说明它们可能是芹菜素抗前列腺癌的关键作用靶点。

综上所述，本研究通过生物信息学联合网络药理学包括分子对接技术，对芹菜素抗前列腺癌的作用机制进行系统性地探索。研究结果证实了芹菜素抗前列腺癌的潜在价值，进一步表明芹菜素通过多靶点、多通路调节前列腺癌细胞对激素反应、调节癌细胞死亡调控激酶的活性，为后续研究及前列腺癌临床治疗提供了理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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基金资助:广东省医学科学技术研究基金项目(A2020239);

文章来源:苏智楷,周映霖,胡磊,等.基于生物信息学与网络药理学的芹菜素抗前列腺癌的分子机制研究[J].现代药物与临床,2024,39(06):1417-1424.