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高频超声在构建SD大鼠皮下移植性乳腺癌模型中的应用

2024-03-14 80 上传者：管理员

摘要：目的:应用MADB-106大鼠乳腺癌细胞悬液皮下移植法建立SD大鼠乳腺癌移植性肿瘤动物模型，并使用高频超声监测肿瘤生长情况。方法:选取7～8周龄雌性SD乳鼠16只，将处于对数生长期的MADB-106大鼠乳腺癌细胞悬液于大鼠腹股沟皮下接种，应用高频超声观察成瘤率、肿块大小、血供情况及其它声像图特征。结果:SD大鼠接种成功率为100%,死亡2只，剩余14只生长良好；超声检查肿块为类圆形，内部低回声且稍不均匀，边界尚清，后方回声衰减，彩色多普勒扫查肿块内部及周边可见较丰富血流信号；3周后切除瘤体组织，大体观肿块成灰白色，多呈椭圆形，部分边缘呈分叶状改变，肿瘤血管较丰富，镜下可见肿瘤细胞大小形状各异，核大深染，异型性明显。结论:通过MADB-106大鼠乳腺癌细胞接种于雌性SD大鼠腹股沟皮下，成功建立了大鼠乳腺癌移植性肿瘤动物模型。高频超声技术可以在SD大鼠乳腺癌皮下成瘤过程中对肿物的大小、形态、边界、内部回声及血流等生物学情况进行动态检测，是观察和评价瘤体动态变化过程的重要技术手段。

关键词：
MADB-106细胞株
乳腺癌
大鼠乳腺癌
移植动物模型
高频超声
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大鼠乳腺癌移植性肿瘤动物模型是指将人或动物的乳腺癌细胞移植到大鼠体内连续传代而形成肿瘤，是最常用的乳腺癌实验动物肿瘤模型，其接种成功率可达100%,获得的肿瘤类生长较一致，个体差异较小，对宿主的影响相似，成本低，实验周期短，实验条件易于控制[1]。对于乳腺癌的诊断，高频多普勒超声不仅能观察肿瘤的形态学特征，也能动态评估肿瘤发生、发展过程以及肿瘤内部血流的变化过程[2]。本文采用MADB-106大鼠乳腺癌细胞株植入雌性SD大乳鼠腹股沟皮下组织，构建大鼠乳腺癌移植瘤模型。造模成功后探讨高频多普勒超声在观察乳腺癌移植肿瘤形态学及血流动力学等特征中的应用。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞株

所用实验动物为雌性SD大鼠(清洁级),由北京华阜康实验动物中心提供，7～8周龄，16只，体重约200～250 g。所用细胞株为MADB-106大鼠乳腺癌细胞，由厦门逸漠生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要试剂和仪器

磷酸缓冲液PBS液(中国上海源培生物科技股份有限公司),RPMI1640培养基(美国康宁公司),胎牛血清(中国上海爱必信生物科技有限公司),0.25%胰蛋白酶(中国天津市灏洋生物制品科技有限责任公司),水合氯醛(中国上海吉至生化有限公司)。

另外，所用超声机器为MX7智能超声显像仪(中国迈瑞公司),高频线阵探头(L20-5s)频率为7～12 MHz, 实验过程中超声显像depth(深度，3.0 cm)、scale(标尺)、TGC(时间增益补偿)等均保持不变。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌细胞培养及雌性SD大鼠饲养

MADB-106大鼠乳腺癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于5%CO2培养箱37 ℃培养，每天换液，隔天传代。

雌性SD大鼠饲养于某医院动物部SPF级动物房，饲以高压灭菌水和饲料，饲养室温度为(23±2)℃,相对湿度为56%±10%,光照12 h, 明暗交替。

1.2.2 制作癌细胞悬浊液及动物模型

选用处于对数生长期且贴壁生长的MADB-106大鼠乳腺癌细胞，用适量0.25%胰蛋白酶消化脱壁后，加入含血清的新鲜培养基终止消化后离心收集细胞，悬于磷酸缓冲液PBS液中，将细胞浓度调整为1×107个/mL,于雌性SD大鼠右腹股沟皮下每个接种点接种0.2 mL,尽快完成操作。每日对大鼠的成瘤情况进行观察，测量瘤体的最横径和纵径，并计算瘤体的体积。

1.2.3 超声扫查

采用中国迈瑞MX7超声诊断显像仪，应用高频线阵探头L20-5s, 探头频率为7～12 MHz, 检查前首先用脱毛剂脱去种植部位体毛，腹腔注射0.5 mL 10%水合氯醛麻醉大鼠，固定后对移植性肿瘤进行全面扫查，首先应用二维超声多切面扫查来观察肿瘤的生物学特征，如肿瘤大小、内部回声、边界、形态等，然后进行彩色多普勒超声(CDFI)检查，观察肿瘤内部及周边的血流动力学特征。

1.2.4 病理学观察

最后一次超声检查结束后，行颈椎脱臼法处死全部荷瘤大鼠，取肿瘤组织后切成大小约10 mm×10 mm×2 mm组织块，然后用10%中性福尔马林固定肿瘤组织24 h, 石蜡包埋后切片行HE染色，光学显微镜观察组织形态。

2、结果

2.1 肿瘤生长情况

肿瘤细胞悬液接种当天，大鼠局部皮下可见由瘤细胞悬液形成的皮丘，次日皮丘吸收，局部皮肤变松软、平整。接种3天后可触及皮下结节，质软，其后瘤体生长迅速，接种3周后，成瘤率为100%,瘤体平均体积可增大至约3.54 cm×2.27 cm, 其中最大肿瘤长径为6.0 cm, 部分可出现皮肤破溃，瘤体的平均生长情况见图1。

图1 肿瘤的生长曲线

2.2 超声声像图特点

早期肿瘤内部回声为较均匀的低回声，形态为尚规则的椭圆形，与周边正常组织界限清晰，彩色多普勒超声显示肿瘤内部为散在分布的点状血流信号。1周后肿瘤生长较为迅速，3周后肿瘤体积明显增大，形态不规则，边界模糊，内部回声变为不均匀混合回声，部分可见液化坏死区及点状强回声钙化，彩色多普勒显示肿块内部及周边见较为丰富血流信号，见图2。

2.3 病理学特征

荷瘤大鼠于皮下种植乳腺癌细胞后第17天、第20天各死亡1只，共2只因瘤体生长过快出现皮肤破溃而死亡，剩余14只存活，3周时断颈处死剩余存活14只大鼠，取肿瘤组织行病理学检查。大体观瘤体为灰白色，质地偏韧，多呈椭圆形，部分可见分叶状改变，部分内部可见液化坏死区，肿瘤边缘及内部血管显示较丰富，见图3。

镜下观肿瘤细胞大小及形态不一，核大深染，胞浆淡染，核分裂象易见，异型性明显，可见巨大瘤细胞及多倍体细胞，见图4。

3、讨论

由于高死亡率和发病率，乳腺癌已成为威胁女性健康的主要问题。即使进行辅助化疗，转移性乳腺癌的5年生存率也不到30%。乳腺癌通常被称为一组疾病，因为存在不同的生物学亚型，反映了不同的分子特征和临床病理特征[3]。因此，建立有效的动物模型及可靠的评价方法，对研究乳腺癌的发生发展和治疗具有重要意义[4]。目前，建立大鼠乳腺癌模型常使用的细胞株为Walker-256[5,6]、SHZ-88[7]以及MADB-106[8]等。其中，MADB-106大鼠乳腺癌细胞，由从化学诱导的Fischer 344大鼠MADB-100乳腺腺癌的肺转移瘤中分离并建立的上皮样细胞，是大鼠乳腺癌细胞系的一种选择性变异，经静脉注射肿瘤细胞到Fischer 44大鼠循环系统后，仅种植转移在大鼠肺部，且肿瘤细胞从肺部的清除和转移的数量受到NK细胞的高度控制[8,9]。MADB-106大鼠乳腺癌细胞移植性乳腺癌模型成功率已接近100%,可在短时间内获得生长较为一致、类型单一的乳腺癌肿瘤，且个体差异较小，成本低，此方法所获得的肿瘤易于观察对照，可在实验动物中连续移植，便于长期研究和成果交流[10]。

图2 大鼠乳腺癌移植肿瘤的超声图像

图3 大鼠乳腺癌移植肿瘤大体标本

图4 种植肿瘤HE染色(×400)

超声检查不仅价格低廉、成像时间短，清晰度和对比度高、诊断准确性强的优点，而且，其无辐射，因此安全性也非常高，综合来说是临床诊断早期乳腺癌的首选方法[11]。普通常规超声包括二维超声和彩色多普勒超声，二维超声可以对肿物的大小、数量、位置、形态变化、边界、内部回声及有无钙化或/和液化区等情况进行全方位的观察和评估，彩色多普勒超声(CDFI)可以对肿物内部及周边的血流丰富程度进行观察，及时发现肿物内部是否存在不规则的穿支血流信号，进而实现对乳腺肿物良恶性的准确判断[12,13]。随着超声技术的研究和发展，弹性成像[14]、超声造影[15]及三维成像[16]等新技术的出现，具有更好的特异性和敏感度，对乳腺癌的诊断起到了重要的补充作用。因此，常规超声联合新技术的检测方法不仅能够提高乳腺癌的检出率，而且不同的超声成像新技术在评估乳腺新辅助化疗疗效等方面发挥着各自的优势[17],能够为乳腺癌患者选择治疗方案及评估预后提供影像学依据[18,19,20]。在本研究中，随着大鼠皮下移植性肿物瘤体积的变化，二维超声观察不仅可见观察到肿瘤体积的变化，还可以观察到肿瘤内部低回声从均匀到不均匀，以及后期(成瘤后约2周到3周)内部出现液化坏死区及点状钙化的动态变化过程，CDFI可显示移植瘤内部血流信号由无到少许点状血流信号，再到逐渐丰富的动态发展过程，这符合人类乳腺恶性肿瘤发展变化过程的超声表现。因此，从本研究制备荷MADB-106大鼠乳腺癌细胞的乳腺癌模型可以获得体积较大的肿瘤，成瘤后的自然消退率也比较低，且声像图特征和病理特征与人乳腺癌较为相似，是研究乳腺癌超声影像的比较理想的移植瘤模型[9]。

综上所述，本研究应用培养MADB-106大鼠乳腺癌细胞悬液于SD大鼠腹股沟区皮下种植法可有效建立大鼠乳腺癌细胞移植瘤模型，成瘤率高(可达100%)、所需周期较短、成本低，瘤体大小适中，是用于影像研究及肿瘤治疗疗效评价的较理想的乳腺癌动物模型[21,22]。而且高频超声技术在SD大鼠乳腺癌皮下成瘤过程中有显著应用价值，可以对肿物的大小、形态、边界、内部回声及血流等生物学情况进行动态检测，是观察和评价瘤体动态变化过程的重要技术手段。

参考文献:

[2]唐灿,赵海娜,文文,等.基于超声特征的乳腺肿块BI-RADS风险分类量化模型建立及验证[J].中国超声医学杂志,2022,38(09):987-991.

[7]艾婷,周军.大鼠乳腺癌皮下移植瘤模型的建立及其超声评价[J].巴楚医学,2020,3(01):44-46,51.

[12]徐云,董桂云,尹莉,等.彩色多普勒超声检查在诊断早期乳腺癌中的应用价值[J].医学影像学杂志,2023,33(09):1684-1687.

[17]袁方,刘从兵,黄娟娟.超声弹性成像技术联合高频彩超诊断乳腺癌的准确性探讨[J].现代医用影像学,2023,32(06):1164-1166.

[20]赵晶,荆慧.多模态超声技术在乳腺癌新辅助化疗疗效评估中的应用[J].现代肿瘤医学,2020,28(23):4181-4184.

[22]李才,任立群.人类疾病动物模型的复制[M].北京:人民卫生出版社,2016:57-60.

文章来源:潘福治,叶冬熳,郑华川等.高频超声在构建SD大鼠皮下移植性乳腺癌模型中的应用[J].现代肿瘤医学,2024,32(08):1393-1396.