肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境中数量最多的细胞群体，在调节肿瘤细胞的上皮-间充质转化（EMT）、干性、耐药性，细胞外基质（ECM）重塑和免疫微环境重塑中起重要作用[1,2,3]。CAFs细胞群体具有高度异质性，乳腺癌微环境中的CAFs可根据特征性基因表达的水平分为多种亚型，包括基质型CAFs(m CAFs）、炎性CAFs(i CAFs）、血管型CAFs(v CAFs）和分裂型CAFs(d CAFs）等，不同亚型CAFs在肿瘤中的功能亦不相同[4,5]。m CAFs和i CAFs是肿瘤微环境中数量最多的两个CAF亚群，m CAFs高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）而低表达白细胞介素（IL)-6[6]，由肿瘤细胞的直接接触激活，通过促进肿瘤ECM重塑、EMT和治疗耐药，促进肿瘤进展[7,8]。i CAFs高表达IL-6而低表达α-SMA，由肿瘤细胞释放的细胞因子如IL-1α和肿瘤坏死因子（TNF)-α激活[9]。iCAFs可通过分泌细胞因子和生长因子，促进肿瘤细胞增殖、转移和肿瘤免疫微环境（TIME）抑制[10]。此外，v CAFs和dCAFs等CAF群体在肿瘤中亦具有不同的功能[11]。因此，生物学特征明确的CAF细胞系的构建对CAF复杂的生物学研究尤为重要。目前，原代CAF细胞系的分离主要依赖于乳腺癌组织中分离并体外培养，然而长期传代易导致细胞衰老，限制了其在离体后的研究和应用。因此，乳腺癌源性CAF细胞模型构建方法的优化亟需解决。本研究通过将人乳腺癌源性CAFs永生化和培养条件的优化，成功构建3个可稳定传代的CAF细胞系，并通过高通量RNA测序（RNA-seq）分析，确定3个CAF细胞系的生物学亚型，为CAFs的体外和体内研究提供了细胞模型。

1、材料与方法

1.1 组织标本来源

收集2022年3—6月济宁医学院附属医院3例乳腺浸润性导管癌患者的新鲜组织，患者临床信息见表1。患者均签署知情同意书，并获得济宁医学院附属医院伦理委员会批准（编号：2021C055）。  

表1 CAFs来源乳腺癌患者临床信息

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

DMEM/F12细胞培养基（Gibco,C11995500BT）、Opti-MEM培养基（Gibco,C119955-00BT,31985-070）、青霉素-链霉素溶液（Gibco,15140-122）、胰蛋白酶（Gibco,25200-072）、谷氨酰胺添加剂GlutaMAX(Gibco,C11995500BT,25030-081）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS)(Gibco,16000-044）、Lipo2000 (Invitrogen,11668-019）、山羊抗兔AF594荧光二抗（Thermo Fisher,A11012）、山羊抗鼠AF488荧光二抗（Thermo Fisher,A11001）、人重组碱性成纤维细胞生长因子（recombinant human FGFbasic,Rh-bFGF)(Proteintec,HZ-1285）、胰岛素（MCE,HY-P0035）、嘌呤霉素（MCE,HY-B1743A）、抗坏血酸（Sigma,PHR1008）、Ⅳ型胶原酶（Sigma,C4-BIOC）、DNase I(Sigma,3750-OP）、PEG8000（翌圣生物，60304ES76）、FGM-2人成纤维细胞培养基（Lonza,cc-3132）、β-半乳糖苷酶染色试剂盒（CST,9860）、α-SMA抗体（CST,19245）、血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor β,PDGFRβ）抗体（CST,4564）、组织保存液（Milteny biotec,130-100-008）、广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin,pan-CK）抗体（中杉金桥，ZM-0069）、人端粒酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）表达质粒pLV-CMV-h TERT（中国丰晖生物科技有限公司）。

1.2.2 主要仪器

正置光学显微镜（NIKON，德国）、倒置荧光显微镜（ZEISS，德国）、低温高速离心机（ThermoScientific，美国）、CO2培养箱（Thermo Scientific，美国）、超净工作台（Thermo Scientific，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 组织的获取与处理

将手术切除的乳腺癌组织剔除脂肪和坏死组织，剪碎至直径小于2 mm，用含有200 U/mL青/链霉素的冰PBS洗涤组织块3次，于组织保存液中保存。

1.3.2 CAFs分离

将1.3.1中的组织块剪碎至直径小于1 mm，加入10 m L组织消化液（DMEM/F12,10%FBS,1 mg/mL胶原酶Ⅳ，300μg/mL DNaseⅠ，200 U/mL青/链霉素），置于37℃摇床，110 r/min消化约25 min，肉眼可见组织松散后，加入20 m L无菌PBS,4℃、400×g离心5 min；用洗涤液将组织块重悬，4℃、400×g离心5 min，重复洗涤步骤2次。将组织沉淀用3 m L培养基重悬后铺在6孔板中，37℃培养箱中孵育48 h。待细胞从组织块中爬出，用镊子小心的移去残留组织块，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，通过差速贴壁法进一步去除上皮细胞。

1.3.3 CAFs免疫荧光鉴定

将处于生长对数期的CAFs消化重悬后铺于腔室载玻片上，细胞贴壁后12 h弃培养基，加入4%多聚甲醛室温固定30 min;PBS浸洗2次后，0.5%Triton-100通透细胞膜；加入3%FBS室温封闭10 min后，分别加入α-SMA(1 100稀释）和pan-CK(1 100稀释）或PDGFRβ(1 100稀释）和pan-CK抗体混合物，4℃孵育过夜；弃抗体，PBS浸洗3次，每次5min，加入对应种属的荧光标记二抗（1 1 000稀释），室温避光孵育30 min；弃抗体，PBS洗涤2次，每次5 min，擦干玻片后滴加含有DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole）的封片剂封片。

1.3.4慢病毒包装

将病毒包装质粒psPAX、pMD2.0 g和hTERT质粒按照4.5μg:1.5μg:6μg混合溶于500μL Opti-MEM培养基，同时将24μL lipo2000溶于500μL Opti-MEM培养基。室温静置5 min后将二者混合，震荡混匀后室温静置10 min，将混合液加入到融合度为80%的293 T细胞中。6 h后更换新鲜培养基，48 h后收集病毒上清，使用20%的PEG8000溶液浓缩病毒。

1.3.5 CAFs永生化

将h TERT慢病毒按照合适比例加入到传代至第3代的CAFs中，24 h后换新鲜培养基，48 h后用终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素筛选，未死亡细胞为感染慢病毒成功的细胞。

1.3.6 培养体系改良

成纤维细胞基础培养基：LonzaFGM-2培养基（Basicmedium,2%FBS,5ng/mL Rh-bFGF,5μg/mL胰岛素，1%青霉素-链霉素溶液）。优化培养基配方：DMEM/F12,1×GlutaMAX,1%非必需氨基酸，10%FBS,5 ng/mL Rh-bFGF,5μg/mL胰岛素，1%双抗，50μg/mL抗坏血酸。

1.3.7 β半乳糖苷酶染色

将贴壁培养的CAFs弃去培养基，使用pH6.0PBS洗涤细胞2次，每次5min，用细胞固定液室温固定30 min，再次使用pH6.0PBS洗涤细胞3次，每次5 min。用X-Gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolylB-D-galactopyranoside）染色液37℃染色过夜，次日弃去染色液，用PBS洗涤后使细胞保持湿润，在光学显微镜下观察拍照。

1.3.8 RNA-seq及生物信息学分析

使用Trizol裂解稳定传代的3个CAF细胞系，设置3个生物学重复，提取细胞总RNA进行RNA-seq，比较3个CAF细胞系的m RNA水平，差异倍数2或0.5且错误发现率（falsediscoveryrate,FDR)0.05认为是差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）。分别比较3个CAF细胞系之间的DEGs，并基于DEGs进行gene ontology(GO）分析，富集得到的信号通路按照FDR 0.05筛选并按照基因数量排序，取排名前20位的信号通路进行展示。基于3个CAF细胞系的CAFs亚型相关基因表达水平，高表达亚型特异性基因集的CAF细胞系被认为具有相关CAF亚型特征。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。正态分布的计量数据用±s表示，两组间差异比较采用非配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 原代CAFs的分离与鉴定

经Ⅳ型胶原酶消化的乳腺癌组织块松散，在37℃培养箱中贴壁培养48 h后，细胞从组织块中迁移爬出，成纤维细胞呈短圆柱状或者扁平梭状，掺杂的上皮细胞呈多边形。第2代细胞中的上皮细胞明显减少。第3代细胞鲜见上皮细胞，且CAFs形态趋向均质，呈扁平梭状（图1A）。取第3代细胞进行细胞免疫荧光染色。结果显示，所有细胞均表达成纤维细胞特征性标志物α-SMA和PDGFRβ，均不表达上皮细胞标志物pan-CK（图1B）。

图1 乳腺癌来源CAFs分离及鉴定

2.2 CAFs永生化

包装纯化hTERT表达慢病毒感染第3代CAFs。感染hTERT的细胞传代2次后，细胞形态趋向均质化，未见衰老表型，而未感染端粒酶的CAFs细胞在第5代后逐渐停止扩增，细胞拉长、扁平、生出多触角，呈现出细胞衰老样形态（图2A）。随着培养代数增加，永生化的细胞趋向均质生长，且无明显的核异型性和衰老样变化（图2B）。

图2 永生化处理与未永生化处理CAFs的细胞形态图片  

2.3 永生化CAFs体外培养优化

在FGM-2培养基中添加非必需氨基酸、谷氨酰胺和抗坏血酸以优化培养条件。永生化CAFs分别使用FGM-2和优化培养基培养，细胞融合至80%左右传代，持续至第50天。结果显示，与FGM-2培养基相比，优化培养基培养的CAFs增殖速度更快，第35天和第50天时X-Gal阳性细胞比例更少（t=2.972、7.049，均P<0.05，图3）。

2.4 CAF1、CAF2和CAF3的RNA-seq数据分析

对3株CAF细胞系进行RNA-seq。结果显示，与CAF2相比，CAF1有1 996个高表达的基因和1 154个低表达的基因（图4A）。CAF1与CAF3仅有343个DEGs（图4B）；与CAF3相比，CAF2有2 490个高表达的基因和1 054个低表达的基因（图4C）。CAF1与CAF3基因表达差异较小。

2.5 3株CAF细胞系的生物学特征分析

基于3株CAFs之间的DEGs进行GO信号通路富集分析，结果显示，与CAF1和CAF3相比，CAF2高表达的基因富集得到的主要是蛋白水解、ECM重塑、血管生成和细胞黏附相关信号通路；与CAF2相比，CAF1和CAF3高表达的基因富集得到的主要是细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂相关信号通路（图5B、5C）。基于3个CAF亚型特征性基因比对分析，发现与CAF1和CAF3相比，CAF2高表达m CAFs相关基因如COL1A1、COL1A2、MMP1和MMP3等；而CAF1和CAF3高表达dCAFs和iCAFs相关基因如MKI67、CDK1、CDK2、IL1A、IL11和CXCL16（图5D）。

图3 不同培养时间下优化培养基与FGM-2培养基培养的CAFs细胞的X-gal染色与定量统计

图4 3个CAFs细胞系的DEGs热图

图5 3株CAF细胞系的DEGs GO分析和CAF亚型特异性基因分析

3、讨论

随着对肿瘤认识的深入，仅针对肿瘤细胞本身的诊疗方案已经不能满足肿瘤精准化治疗的需求，针对肿瘤微环境细胞如CAFs和免疫细胞的治疗越来越被重视[12,13]。CAFs与肿瘤细胞交互作用的研究依赖于细胞系和转基因动物模型[14,15]。而乳腺癌源性CAFs体外培养传代易发生衰老表型，限制了其在基因改造和肿瘤细胞共培养等实验中的应用。因此，原代CAFs在体外稳定、长期培养的问题亟需解决。本研究通过酶解-组织培养法分离得到3例乳腺癌CAFs，细胞免疫荧光明确了提取得到的细胞均为CAFs。TERT是真核细胞维持端粒长度的核心组分，端粒长度的维持可减少细胞在DNA复制过程中的损伤，延长细胞寿命[16]。在正常细胞中过表达端粒酶可防止细胞发生DNA复制型衰老。本研究中使用hTERT慢病毒感染CAFs，与野生型原代CAFs相比，使用hTERT感染的CAFs短期未见明显衰老样变化，提示过表达端粒酶可延缓体外培养CAFs的衰老样表型。体外培养CAFs所用培养基目前尚无统一标准，文献中使用较多的是细胞基础培养基（DMEM,10%FBS,1%青霉素-链霉素溶液）[17]。与细胞基础培养基相比，Lonza公司出品的成纤维细胞培养基FGM-2可延长CAFs体外培养时间[18]。有报道指出，抗坏血酸可减轻各种理化因素对成纤维细胞造成的DNA损伤[19,20,21]，非必需氨基酸和谷氨酰胺可以增加细胞稳态，增加细胞存活率[22,23]。因此，本研究在FGM-2的基础上，添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和50μg/mL抗坏血酸进行优化。X-Gal衰老相关染色证实，优化培养基培养的永生化CAFs在第15代未发现明显衰老特征。以上实验结果证实，在本研究优化的培养体系下，永生化的CAF细胞系可作为稳定的CAF模型。

CAFs是肿瘤间质细胞的主要成分，具有很强的异质性[4,5]。伴随单细胞测序、空间转录组测序和组织多色共染等技术的推广，对CAF的异质性得到了更深层次的认识[24,25,26]。在人乳腺癌中，CAFs被分为m CAFs、iCAFs和dCAFs等亚群，同一亚群的CAFs具有相似的基因表达特征和生物学特性，不同亚群的CAF细胞对肿瘤的作用有很大区别，因此，明确乳腺癌微环境中CAF亚型的分布和比例在指导乳腺癌诊断和治疗策略选择中起重要作用。本研究中对3例永生化CAFs进行RNA-Seq，通过分析3者DEGs及其功能聚类分析，发现与CAF1、CAF3细胞系相比，CAF2高表达蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附相关等信号通路的相关基因；CAF1与CAF3高表达细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路的相关基因。以上结果提示，尽管同样来源于Luminal B型乳腺癌，不同患者分离得到的CAFs具有显著的生物学特征差异，选择细胞模型为研究载体时应当严谨考虑。通过对本研究中构建CAF细胞系的亚群特征性基因表达水平分析，发现CAF1与CAF3高表达i CAFs和dCAFs相关基因，提示CAF1与CAF3可能主要由i CAFs或d CAFs构成，促进TIME重塑和CAFs增殖[27]；而CAF2高表达m CAFs相关基因，可能主要由m CAFs构成，促进肿瘤细胞EMT、耐药和细胞外基质的重塑[28]。

原代CAF细胞系是研究肿瘤微环境中不同类型细胞间交互作用不可替代的实验工具。本研究丰富了CAF细胞系来源，增加了体外培养的细胞稳定性和传代次数，明确了获得CAFs的生物学特征，为CAFs研究提供了可靠细胞模型。

基金资助:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK-009A);

文章来源:付豪,冯玉梅.乳腺癌源性肿瘤相关成纤维细胞的永生化及鉴定[J].天津医科大学学报,2024,30(04):289-294.