![](/static/index/images/icon-home.png)
摘要:目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角蛋白;采用人端粒酶表达慢病毒感染CAFs使其永生化;在商品化FGM-2(fibroblast growth medium-2)培养基的基础上添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗坏血酸以优化培养条件,在体外连续培养传代,并用β-半乳糖苷酶染色鉴定各代细胞中衰老细胞的比例。对构建成功的CAF1、CAF2和CAF3细胞系进行高通量RNA测序,分析差异表达基因(DEGs)及其相关信号通路;基于3个CAF细胞系CAF亚型标志基因的表达水平,鉴定其生物学特征。结果:成功分离原代CAFs,并构建3株永生化CAF细胞系;成功优化了CAFs的培养条件,使CAF细胞系在体外培养时不易发生细胞衰老表型(t=2.972、7.049,均P<0.05);RNA测序结果分析显示,CAF1与CAF2有3 150个DEGs,CAF2与CAF3有3 544个DEGs;而CAF1与CAF3有343个DEGs。对DEGs进行GO富集分析(gene ontology enrichment analysis)表明,CAF2高表达基因主要参与蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附等信号通路;CAF1和CAF3高表达基因主要参与细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路。对3个CAF细胞系亚型特征性分析表明,CAF1和CAF 3具有炎性CAFs特征,CAF2具有基质型CAFs特征。结论:成功构建得到3株可在体外稳定传代且具有不同生物学特征的CAF细胞系,为CAFs在乳腺癌发生和进展中作用机制的研究提供了可靠的细胞模型。
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中数量最多的细胞群体,在调节肿瘤细胞的上皮-间充质转化(EMT)、干性、耐药性,细胞外基质(ECM)重塑和免疫微环境重塑中起重要作用[1,2,3]。CAFs细胞群体具有高度异质性,乳腺癌微环境中的CAFs可根据特征性基因表达的水平分为多种亚型,包括基质型CAFs(m CAFs)、炎性CAFs(i CAFs)、血管型CAFs(v CAFs)和分裂型CAFs(d CAFs)等,不同亚型CAFs在肿瘤中的功能亦不相同[4,5]。m CAFs和i CAFs是肿瘤微环境中数量最多的两个CAF亚群,m CAFs高表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)而低表达白细胞介素(IL)-6[6],由肿瘤细胞的直接接触激活,通过促进肿瘤ECM重塑、EMT和治疗耐药,促进肿瘤进展[7,8]。i CAFs高表达IL-6而低表达α-SMA,由肿瘤细胞释放的细胞因子如IL-1α和肿瘤坏死因子(TNF)-α激活[9]。iCAFs可通过分泌细胞因子和生长因子,促进肿瘤细胞增殖、转移和肿瘤免疫微环境(TIME)抑制[10]。此外,v CAFs和dCAFs等CAF群体在肿瘤中亦具有不同的功能[11]。因此,生物学特征明确的CAF细胞系的构建对CAF复杂的生物学研究尤为重要。目前,原代CAF细胞系的分离主要依赖于乳腺癌组织中分离并体外培养,然而长期传代易导致细胞衰老,限制了其在离体后的研究和应用。因此,乳腺癌源性CAF细胞模型构建方法的优化亟需解决。本研究通过将人乳腺癌源性CAFs永生化和培养条件的优化,成功构建3个可稳定传代的CAF细胞系,并通过高通量RNA测序(RNA-seq)分析,确定3个CAF细胞系的生物学亚型,为CAFs的体外和体内研究提供了细胞模型。
1、材料与方法
1.1 组织标本来源
收集2022年3—6月济宁医学院附属医院3例乳腺浸润性导管癌患者的新鲜组织,患者临床信息见表1。患者均签署知情同意书,并获得济宁医学院附属医院伦理委员会批准(编号:2021C055)。
表1 CAFs来源乳腺癌患者临床信息
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
DMEM/F12细胞培养基(Gibco,C11995500BT)、Opti-MEM培养基(Gibco,C119955-00BT,31985-070)、青霉素-链霉素溶液(Gibco,15140-122)、胰蛋白酶(Gibco,25200-072)、谷氨酰胺添加剂GlutaMAX(Gibco,C11995500BT,25030-081)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco,16000-044)、Lipo2000 (Invitrogen,11668-019)、山羊抗兔AF594荧光二抗(Thermo Fisher,A11012)、山羊抗鼠AF488荧光二抗(Thermo Fisher,A11001)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human FGFbasic,Rh-bFGF)(Proteintec,HZ-1285)、胰岛素(MCE,HY-P0035)、嘌呤霉素(MCE,HY-B1743A)、抗坏血酸(Sigma,PHR1008)、Ⅳ型胶原酶(Sigma,C4-BIOC)、DNase I(Sigma,3750-OP)、PEG8000(翌圣生物,60304ES76)、FGM-2人成纤维细胞培养基(Lonza,cc-3132)、β-半乳糖苷酶染色试剂盒(CST,9860)、α-SMA抗体(CST,19245)、血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor β,PDGFRβ)抗体(CST,4564)、组织保存液(Milteny biotec,130-100-008)、广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin,pan-CK)抗体(中杉金桥,ZM-0069)、人端粒酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达质粒pLV-CMV-h TERT(中国丰晖生物科技有限公司)。
1.2.2 主要仪器
正置光学显微镜(NIKON,德国)、倒置荧光显微镜(ZEISS,德国)、低温高速离心机(ThermoScientific,美国)、CO2培养箱(Thermo Scientific,美国)、超净工作台(Thermo Scientific,美国)。
1.3 实验方法
1.3.1 组织的获取与处理
将手术切除的乳腺癌组织剔除脂肪和坏死组织,剪碎至直径小于2 mm,用含有200 U/mL青/链霉素的冰PBS洗涤组织块3次,于组织保存液中保存。
1.3.2 CAFs分离
将1.3.1中的组织块剪碎至直径小于1 mm,加入10 m L组织消化液(DMEM/F12,10%FBS,1 mg/mL胶原酶Ⅳ,300μg/mL DNaseⅠ,200 U/mL青/链霉素),置于37℃摇床,110 r/min消化约25 min,肉眼可见组织松散后,加入20 m L无菌PBS,4℃、400×g离心5 min;用洗涤液将组织块重悬,4℃、400×g离心5 min,重复洗涤步骤2次。将组织沉淀用3 m L培养基重悬后铺在6孔板中,37℃培养箱中孵育48 h。待细胞从组织块中爬出,用镊子小心的移去残留组织块,用胰蛋白酶消化贴壁细胞,通过差速贴壁法进一步去除上皮细胞。
1.3.3 CAFs免疫荧光鉴定
将处于生长对数期的CAFs消化重悬后铺于腔室载玻片上,细胞贴壁后12 h弃培养基,加入4%多聚甲醛室温固定30 min;PBS浸洗2次后,0.5%Triton-100通透细胞膜;加入3%FBS室温封闭10 min后,分别加入α-SMA(1 100稀释)和pan-CK(1 100稀释)或PDGFRβ(1 100稀释)和pan-CK抗体混合物,4℃孵育过夜;弃抗体,PBS浸洗3次,每次5min,加入对应种属的荧光标记二抗(1 1 000稀释),室温避光孵育30 min;弃抗体,PBS洗涤2次,每次5 min,擦干玻片后滴加含有DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)的封片剂封片。
1.3.4慢病毒包装
将病毒包装质粒psPAX、pMD2.0 g和hTERT质粒按照4.5μg:1.5μg:6μg混合溶于500μL Opti-MEM培养基,同时将24μL lipo2000溶于500μL Opti-MEM培养基。室温静置5 min后将二者混合,震荡混匀后室温静置10 min,将混合液加入到融合度为80%的293 T细胞中。6 h后更换新鲜培养基,48 h后收集病毒上清,使用20%的PEG8000溶液浓缩病毒。
1.3.5 CAFs永生化
将h TERT慢病毒按照合适比例加入到传代至第3代的CAFs中,24 h后换新鲜培养基,48 h后用终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素筛选,未死亡细胞为感染慢病毒成功的细胞。
1.3.6 培养体系改良
成纤维细胞基础培养基:LonzaFGM-2培养基(Basicmedium,2%FBS,5ng/mL Rh-bFGF,5μg/mL胰岛素,1%青霉素-链霉素溶液)。优化培养基配方:DMEM/F12,1×GlutaMAX,1%非必需氨基酸,10%FBS,5 ng/mL Rh-bFGF,5μg/mL胰岛素,1%双抗,50μg/mL抗坏血酸。
1.3.7 β半乳糖苷酶染色
将贴壁培养的CAFs弃去培养基,使用pH6.0PBS洗涤细胞2次,每次5min,用细胞固定液室温固定30 min,再次使用pH6.0PBS洗涤细胞3次,每次5 min。用X-Gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolylB-D-galactopyranoside)染色液37℃染色过夜,次日弃去染色液,用PBS洗涤后使细胞保持湿润,在光学显微镜下观察拍照。
1.3.8 RNA-seq及生物信息学分析
使用Trizol裂解稳定传代的3个CAF细胞系,设置3个生物学重复,提取细胞总RNA进行RNA-seq,比较3个CAF细胞系的m RNA水平,差异倍数2或0.5且错误发现率(falsediscoveryrate,FDR)0.05认为是差异表达基因(differential expressed genes,DEGs)。分别比较3个CAF细胞系之间的DEGs,并基于DEGs进行gene ontology(GO)分析,富集得到的信号通路按照FDR 0.05筛选并按照基因数量排序,取排名前20位的信号通路进行展示。基于3个CAF细胞系的CAFs亚型相关基因表达水平,高表达亚型特异性基因集的CAF细胞系被认为具有相关CAF亚型特征。
1.4 统计学处理
采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。正态分布的计量数据用±s表示,两组间差异比较采用非配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 原代CAFs的分离与鉴定
经Ⅳ型胶原酶消化的乳腺癌组织块松散,在37℃培养箱中贴壁培养48 h后,细胞从组织块中迁移爬出,成纤维细胞呈短圆柱状或者扁平梭状,掺杂的上皮细胞呈多边形。第2代细胞中的上皮细胞明显减少。第3代细胞鲜见上皮细胞,且CAFs形态趋向均质,呈扁平梭状(图1A)。取第3代细胞进行细胞免疫荧光染色。结果显示,所有细胞均表达成纤维细胞特征性标志物α-SMA和PDGFRβ,均不表达上皮细胞标志物pan-CK(图1B)。
图1 乳腺癌来源CAFs分离及鉴定
2.2 CAFs永生化
包装纯化hTERT表达慢病毒感染第3代CAFs。感染hTERT的细胞传代2次后,细胞形态趋向均质化,未见衰老表型,而未感染端粒酶的CAFs细胞在第5代后逐渐停止扩增,细胞拉长、扁平、生出多触角,呈现出细胞衰老样形态(图2A)。随着培养代数增加,永生化的细胞趋向均质生长,且无明显的核异型性和衰老样变化(图2B)。
图2 永生化处理与未永生化处理CAFs的细胞形态图片
2.3 永生化CAFs体外培养优化
在FGM-2培养基中添加非必需氨基酸、谷氨酰胺和抗坏血酸以优化培养条件。永生化CAFs分别使用FGM-2和优化培养基培养,细胞融合至80%左右传代,持续至第50天。结果显示,与FGM-2培养基相比,优化培养基培养的CAFs增殖速度更快,第35天和第50天时X-Gal阳性细胞比例更少(t=2.972、7.049,均P<0.05,图3)。
2.4 CAF1、CAF2和CAF3的RNA-seq数据分析
对3株CAF细胞系进行RNA-seq。结果显示,与CAF2相比,CAF1有1 996个高表达的基因和1 154个低表达的基因(图4A)。CAF1与CAF3仅有343个DEGs(图4B);与CAF3相比,CAF2有2 490个高表达的基因和1 054个低表达的基因(图4C)。CAF1与CAF3基因表达差异较小。
2.5 3株CAF细胞系的生物学特征分析
基于3株CAFs之间的DEGs进行GO信号通路富集分析,结果显示,与CAF1和CAF3相比,CAF2高表达的基因富集得到的主要是蛋白水解、ECM重塑、血管生成和细胞黏附相关信号通路;与CAF2相比,CAF1和CAF3高表达的基因富集得到的主要是细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂相关信号通路(图5B、5C)。基于3个CAF亚型特征性基因比对分析,发现与CAF1和CAF3相比,CAF2高表达m CAFs相关基因如COL1A1、COL1A2、MMP1和MMP3等;而CAF1和CAF3高表达dCAFs和iCAFs相关基因如MKI67、CDK1、CDK2、IL1A、IL11和CXCL16(图5D)。
图3 不同培养时间下优化培养基与FGM-2培养基培养的CAFs细胞的X-gal染色与定量统计
图4 3个CAFs细胞系的DEGs热图
图5 3株CAF细胞系的DEGs GO分析和CAF亚型特异性基因分析
3、讨论
随着对肿瘤认识的深入,仅针对肿瘤细胞本身的诊疗方案已经不能满足肿瘤精准化治疗的需求,针对肿瘤微环境细胞如CAFs和免疫细胞的治疗越来越被重视[12,13]。CAFs与肿瘤细胞交互作用的研究依赖于细胞系和转基因动物模型[14,15]。而乳腺癌源性CAFs体外培养传代易发生衰老表型,限制了其在基因改造和肿瘤细胞共培养等实验中的应用。因此,原代CAFs在体外稳定、长期培养的问题亟需解决。本研究通过酶解-组织培养法分离得到3例乳腺癌CAFs,细胞免疫荧光明确了提取得到的细胞均为CAFs。TERT是真核细胞维持端粒长度的核心组分,端粒长度的维持可减少细胞在DNA复制过程中的损伤,延长细胞寿命[16]。在正常细胞中过表达端粒酶可防止细胞发生DNA复制型衰老。本研究中使用hTERT慢病毒感染CAFs,与野生型原代CAFs相比,使用hTERT感染的CAFs短期未见明显衰老样变化,提示过表达端粒酶可延缓体外培养CAFs的衰老样表型。体外培养CAFs所用培养基目前尚无统一标准,文献中使用较多的是细胞基础培养基(DMEM,10%FBS,1%青霉素-链霉素溶液)[17]。与细胞基础培养基相比,Lonza公司出品的成纤维细胞培养基FGM-2可延长CAFs体外培养时间[18]。有报道指出,抗坏血酸可减轻各种理化因素对成纤维细胞造成的DNA损伤[19,20,21],非必需氨基酸和谷氨酰胺可以增加细胞稳态,增加细胞存活率[22,23]。因此,本研究在FGM-2的基础上,添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和50μg/mL抗坏血酸进行优化。X-Gal衰老相关染色证实,优化培养基培养的永生化CAFs在第15代未发现明显衰老特征。以上实验结果证实,在本研究优化的培养体系下,永生化的CAF细胞系可作为稳定的CAF模型。
CAFs是肿瘤间质细胞的主要成分,具有很强的异质性[4,5]。伴随单细胞测序、空间转录组测序和组织多色共染等技术的推广,对CAF的异质性得到了更深层次的认识[24,25,26]。在人乳腺癌中,CAFs被分为m CAFs、iCAFs和dCAFs等亚群,同一亚群的CAFs具有相似的基因表达特征和生物学特性,不同亚群的CAF细胞对肿瘤的作用有很大区别,因此,明确乳腺癌微环境中CAF亚型的分布和比例在指导乳腺癌诊断和治疗策略选择中起重要作用。本研究中对3例永生化CAFs进行RNA-Seq,通过分析3者DEGs及其功能聚类分析,发现与CAF1、CAF3细胞系相比,CAF2高表达蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附相关等信号通路的相关基因;CAF1与CAF3高表达细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路的相关基因。以上结果提示,尽管同样来源于Luminal B型乳腺癌,不同患者分离得到的CAFs具有显著的生物学特征差异,选择细胞模型为研究载体时应当严谨考虑。通过对本研究中构建CAF细胞系的亚群特征性基因表达水平分析,发现CAF1与CAF3高表达i CAFs和dCAFs相关基因,提示CAF1与CAF3可能主要由i CAFs或d CAFs构成,促进TIME重塑和CAFs增殖[27];而CAF2高表达m CAFs相关基因,可能主要由m CAFs构成,促进肿瘤细胞EMT、耐药和细胞外基质的重塑[28]。
原代CAF细胞系是研究肿瘤微环境中不同类型细胞间交互作用不可替代的实验工具。本研究丰富了CAF细胞系来源,增加了体外培养的细胞稳定性和传代次数,明确了获得CAFs的生物学特征,为CAFs研究提供了可靠细胞模型。
基金资助:天津市医学重点学科(专科)建设项目(TJYXZDXK-009A);
文章来源:付豪,冯玉梅.乳腺癌源性肿瘤相关成纤维细胞的永生化及鉴定[J].天津医科大学学报,2024,30(04):289-294.
分享:
肿瘤微环境(TME)是指肿瘤周围包括细胞、分子及物理化学环境等的复杂环境,这些环境会影响肿瘤细胞的生长、扩散、恶化和对治疗的反应[6]。随着研究的深入,学者们发现TME内包括肿瘤细胞周围的血管、成纤维细胞、神经元、炎症细胞、免疫细胞,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等各种细胞和分子[7-11]。
2024-09-04由于疾病和治疗的影响,大多数乳腺癌患者会经历症状负担、情感绝望、身体意象紊乱、认知情绪变化等[3-5],面对巨大的隐性成本和相关痛苦与经济负担的失衡,患者往往隐瞒病情[2]。自我隐瞒作为一种以控制和回避为中心的适应不良情绪/行为调节策略[6],是个体有意识地向他人隐瞒痛苦或消极个人信息的心理倾向[7]。
2024-08-27研究[1]指出,每年因乳腺癌死亡的女性约1.3万,在所有女性恶性肿瘤中排第一位。导致乳腺癌患者死亡的主要原因是淋巴结转移,其中腋窝淋巴结转移是最常见现象。现今国际上公认,尽早发现、诊断乳腺癌,及时采用有效治疗方案,可延长患者生存时间,降低患者死亡率[2]。
2024-08-26乳腺癌为女性高发恶性肿瘤[1],骨骼是晚期乳腺癌最常见的转移部位[2-3],约占转移病例的70%,导致骨骼相关事件的高发病率[4-5]。乳腺癌骨转移本身预后良好,但由于骨微环境的复杂性,易形成乳腺癌细胞与骨微环境之间的恶性循环,造成溶骨性转移。
2024-08-22近年来,乳腺癌在女性群体中的患病率呈明显上升趋势,其在女性恶性肿瘤中的发病率居于首位,严重威胁女性群体的健康[1]。乳腺癌具有隐匿性,发病早期症状并不明显,多数患者在确诊时已发展至中晚期,癌细胞已向远处转移。调查发现,乳腺癌出现细胞远端转移患者的生存率明显降低[2-3]。
2024-08-20近年来乳腺对比增强X线摄影(contrast-enhanced spectral mammography, CESM)在临床逐渐应用,可于注射对比剂后一次压迫同时获得低能图及高能图,经计算机处理后获得减影图,为乳腺疾病的诊断提供信息[3-5]。鉴于此,本研究将探讨CESM在乳腺良、恶性病变鉴别诊断中的作用,以提升乳腺癌检出率。
2024-08-19社会疏离(social alienation)是指个体在社交环境中感受到的孤独、无助及被排斥的消极情绪,并表现出回避、拒绝等消极行为的现象[4]。研究显示,乳腺癌患者存在一定水平的社会疏离,使患者难以回归正常生活[5]。未满足需求(unmet needs):是指癌症幸存者需要、关注而未被满足的需求[6]。
2024-08-16Luminal B型乳腺癌是乳腺癌重要分型之一,早期无明显症状,随病情发展可出现乳房肿块、乳房皮肤改变及乳腺刺痛等局部症状,临床具有增殖和侵袭力强、易发生转移、术后复发风险大等特征,因其发病机制较为复杂、临床特征多样,治疗相对棘手、预后相对较差[3-4]。
2024-08-12乳腺癌目前是人类发病率较高的癌种。乳腺癌治愈的关键是改变其易转移的生物学行为。与这一生物学行为相关的基因非常多,其中金属基质转移酶相关基因(matrix metalloproteinases, MMP)具有举足轻重的作用。随着研究工作的推进,人们发现,每一种MMP都有着和它对应的基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)。
2024-08-08乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年升高趋势,且呈年轻化趋势[1]。相关数据显示,在2020年全球新发女性乳腺癌患者病例数有226.1万,位居世界新发恶性肿瘤的首位,是导致女性过早死亡的主要病因之一[2]。外科手术切除是治疗乳腺癌的首选方案,可有效切除病灶组织,改善患者生活质量,延长生存期限[3]。
2024-08-08人气:19613
人气:14989
人气:14183
人气:14126
人气:14037
我要评论
期刊名称:肿瘤学杂志
期刊人气:1379
主管单位:浙江省卫生和计划生育委员会
主办单位:浙江省肿瘤医院,浙江省抗癌协会
出版地方:浙江
专业分类:医学
国际刊号:1671-170X
国内刊号:33-1266/R
邮发代号:32-37
创刊时间:1977年
发行周期:月刊
期刊开本:大16开
见刊时间:10-12个月
影响因子:1.474
影响因子:2.876
影响因子:0.899
影响因子:0.000
影响因子:2.153
400-069-1609
您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!
你的密码已发送到您的邮箱,请查看!