食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell cancer,ESCC）是我国主要的食管癌类型，虽近年发病率呈逐年下降趋势，但依然高于全球平均水平[1]。随着医疗水平的不断提高，ESCC的治疗效果得到很大程度的提升，但因缺乏有效的早期诊断标志物与抑制肿瘤转移的治疗靶点，ESCC患者的预后较差[2]。因此，筛选出有效的标志物对于ESCC患者早期诊断以及预后预测具有重要价值。核因子（NF）κB激酶亚单位ε抑制剂（Nuclear factor-κB kinase sub unit ε inhibitor,IKBKE）属于非经典抑制κB(inhibitorκB,IκB）激酶，可通过调控多种信号通路抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，促进细胞凋亡。近年来，已有研究表明IKBKE在人乳腺癌、脑胶质瘤等肿瘤中表达异常，并在肿瘤的病理进程中起着关键作用，其可能作为肿瘤潜在的治疗靶点[3,4]。既往黄璐等[5]研究已表明IKBKE在ESCC组织中高表达，且与患者术后复发转移密切相关，其可作为ESCC患者潜在的治疗靶点。然而，IKBKE在ESCC组织与细胞作用及相关机制的研究目前尚不明确。基于此，本研究进一步探讨IKBKE在ESCC组织中的表达及其沉默对ESCC细胞生物行为学的影响，旨在为后期ESCC的临床靶点治疗奠定基础。

1、材料和方法

1.1 临床材料

收集2020年6月至2023年6月行ESCC根治术的30例患者，留取患者的ESCC病灶组织以及对应的癌旁组织（距癌组织≤5cm）作为对照。纳入标准：（1）经病理活检诊断为ESCC。（2）术前均未经过放疗与化疗。（3）无合并其原发性肿瘤。其中男性17例，女性13例，年龄平均（62.37±8.16）岁；高分化3例，中分化10例，低分化17例；TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；淋巴转移18例，无淋巴转移12例；浸润深度T1～T2 13例，T3～T4 17例。本研究患者均对本研究知情同意，且本研究通过本院的伦理委员会审核（伦理审批号：2023011146）。

1.2 主要材料与试剂

人ESCC细胞系KYSE-30购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；RP-MI1640培养基、胰酶、青链霉素（购自Hyclone）；胎牛血清（美国Gibco);TRIzol试剂、反转录试剂盒（日本Ta KaRa）；实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo);Matrigel胶及Transwell小室（美国Coming);TRIzol试剂及Lipofectamine2000（美国Invriogen);IKBKE-siRNA及NC-siRNA质粒（上海吉凯基因）；兔抗IKBKE、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(phosphonated inhibitor of NF-κBα,p-IκBα）、Tubulin抗体（美国Abcam);HRP标记的山羊抗兔二抗、CCK-8试剂盒、细胞凋亡试剂盒（北京索莱宝）；引物序列由上海生工生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组及转染

将人ESCC细胞株用含10%FBS、1%双抗（100U/m L青霉素及100mg/L链霉素）的RPMI-1640完全培养基置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。每2～3 d换液1次，当细胞生长至90%密度时，0.25%胰酶消化按照1 3的比例进行传代培养，取对数生长期的第三代细胞进行后续实验。将细胞分为空白对照组（不做任何处理），NC-IKBKE组（转染NC-siRNA质粒），siIKBKE组（转染IKBKE-siRNA质粒）。si-RNA转染方法：取对数生长期的细胞经过胰酶消化、洗涤，离心、重悬，取5×104/mL细胞悬液接种无抗生素的6孔板中培养，待细胞生长至50%～60%密度时，分别取4μL IKBKE-siRNA质粒溶于250μL无血清培养基混匀，取10μL的lipo2000溶于250μL无血清培养基，室温放置5 min，将以上两种混合液混匀室温放置20 min后均匀加入到6孔板细胞液中，置于培养箱中继续培养4～6 h，更换无双抗新鲜培养基继续培养，NC-IKBKE组转染NC-siRNA，方法同上。培养至24～72 h进行相应实验。

1.3.2 qRT-PCR法测定IKBKE表达水平

收集30例患者癌组织、癌旁组织与各组转染培养48 h细胞，使用TRIzol法提取总RNA，依据反转录试剂盒将其转录为c DNA，运用qRT-PCR检测IKBKE表达，反应条件：95℃2 min,95℃15 s,60℃30 s,72℃30 s共40个循环，IKBKE上游引物：5'-TGCG TGCAGAAGTATCAAGC-3'，下游引物：5'-TACAGG CAGCCACAGAACAG-3';GAPDH内参上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；计算IKBKE基因的m RNA相对表达量。

1.3.3 蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）法测定IKBKE相关蛋白表达水平

收集30例患者癌组织以及癌旁组织，以及各组转染培养48 h细胞，分别提取组织与各组细胞总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入loadingbuffer煮沸5min，取30μg蛋白溶液进行SDS-PAGE(80 V 30 min、100V90min），电泳结束后将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜3次，一抗[兔抗IKBKE(110000）、NF-κB p65(110000）、p-IκBα(110000）、GAPDH(1 10 000）、Tubulin(1 5 000)]4℃孵育过夜；二抗[山羊抗兔IgG抗体（1 5 000）]室温避光孵育2 h;ECL法进行显色，使用凝胶成像仪拍照观察组织与细胞中IKBKE蛋白表达，以及细胞中NF-κB p65、p-IκBα蛋白表示情况，并采用Image J软件依据蛋白条带灰度值分析IKBKE、NF-κB p65、pIκBα蛋白的相对表达量。

1.3.4 CCK-8检测细胞的增殖

待转染后的各组细胞稳定后，将其经消化、洗涤、重悬，调整浓度至3×104/mL接种至96孔板中，在37℃下培养24、48、72 h后，每孔均加入10μL CCK-8试剂继续培养2 h，检测各孔细胞在450 nm处的OD值，分析细胞的增殖能力，实验重复3次。

1.3.5 划痕愈合法检测细胞迁移能力

将各组细胞接种至6孔板中，转染后继续培养24 h，用10μL枪头做划痕愈合实验，之后用PBS洗去脱落细胞，分别于划痕后的0、24、48 h拍照观察划痕宽度。计算各组细胞的迁移率。细胞迁移率（%）=（0 h划痕距离-48h划痕距离）/（0h划痕距离）×100%。实验重复3次。

1.3.6 Transwell法检测细胞侵袭能力

细胞转染后继续培养24 h，消化细胞，用无血清的培养基稀释至细胞密度为5×105个/m L，用预冷RPMI1640培养基按照1 8的比例稀释Matrigel基质胶，向已被置入基质胶的上室加入200μL细胞悬液，下室加入600μL含10%FBS培养基，37℃继续培养48 h，吸去上室培养液，4%的多聚甲醛组织固定液固定30 min,PBS洗2遍，1%结晶紫染液于24孔板中30 min,PBS洗涤3次并倒置风干，倒置显微镜下观察细胞穿膜情况。每张膜选5个视野拍照，计算平均细胞数，计算各组细胞侵袭抑制率。细胞侵袭抑制率（%）=（对照组穿膜细胞数-观察组穿膜细胞数）/对照组穿膜细胞数×100%。

1.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡

待各组细胞转染后培养48 h后，常规消化处理，洗涤，制备细胞悬液（浓度为1×106个/mL），加入5μL Annexin V-FITC混匀，4℃避光孵育30min，再加入10μLPI,4℃避光孵育5 min，最后加入400μL缓冲液，上机采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.4 统计学处理

使用SPSS22.0软件进行数据统计分析，计量资料且符合正态分布则运用±s表示，多组间数据比较使用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ESCC组织及其癌旁组织中的IKBKE的表达水平

经q RT-PCR及WB结果显示，ESCC组中的IKBKE的m RNA及蛋白表达水平均显著高于对照组（t=9.769、12.960，均P=0.000），见图1。

图1 qRT-PCR及WB法检测ESCC组织及其癌旁组织中的IK-BKE的表达

2.2 IKBKE表达水平与ESCC患者临床病理特征的关系

结果显示，IKBKE在ESCC组织中的m R-NA以及蛋白表达水平与ESCC患者的性别、年龄、浸润深度比较均无显著差异（均P>0.05），而与肿瘤分化程度、TNM分期以及是否转移比较均具有统计学意义（P<0.05），见表1。  

表1 IKBKE表达与ESCC患者临床病理特征的关系（±s)  

2.3 ESCC细胞系KYSE-30中IKBKE的表达水平

qRT-PCR及WB结果显示，与NC-IKBKE组相比，si-IKBKE组细胞中的IKBKE m RNA以及蛋白水平均显著降低（F=77.244、78.436，均P=0.000），空白对照组与NC-IKBKE组的细胞IKBKE m RNA以及蛋白水平均无明显差异（P>0.05），见图2。

图2 qR T-PCR及Western印迹法检测KYSE-30细胞中IKBKE表达水平  

2.4 沉默IKBKE对ESCC细胞株KYSE-30增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，空白对照与NC-IKBKE组24、48、72 h的细胞增殖能力比较差异无统计学意义（均P>0.05），与NC-IKBKE组相比，si-IKBKE组的KYSE-30细胞24 h增殖能力无明显差异（P>0.05），而48、72 h时，si-IKBKE组的KYSE-30细胞增殖能力均显著下降（F=18.547、36.518,P=0.003、0.000），见图3。

图3 CCK-8法检测KYSE-30细胞增殖能力

2.5 沉默IKBKE对ESCC细胞株KYSE-30迁移能力的影响

划痕实验结果显示，空白对照与NC-IKBKE组的24与48 h的细胞迁移率比较差异无统计学意义（P>0.05），与NC-IKBKE组相比，siIKBKE组24、48 h的细胞迁移率均显著降低（F=12.355、44.755,P=0.007、0.000），见图4。

图4 划痕愈合法检测KYSE-30细胞迁移能力

2.6 沉默IKBKE对ESCC细胞株KYSE-30的细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，空白对照组与NC-IKBKE组48 h的细胞侵袭抑制率比较差异无统计学意义（P>0.05），与NC-IKBKE组相比，si-IKBKE组48 h的细胞侵袭抑制率显著增加（F=155.436,P=0.000），见图5。

图5 Transwell法检测KYSE-30细胞侵袭能力  

2.7 沉默IKBKE对ESCC细胞株KYSE-30的细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，空白对照组与NC-IKBKE组的细胞凋亡率比较无显著差异（P>0.05），与NC-IKBKE组相比，si-IKBKE组的细胞凋亡率均显著增加（F=46.360,P=0.000），见图6。

图6 流式细胞术检测KYSE-30细胞凋亡率   

2.8 沉默IKBKE对ESCC KYSE-30细胞中NF-κB信号通路相关蛋白的影响

为了验证IKBKE对KYSE-30细胞的增殖、迁移、侵袭以及凋亡生物行为学的潜在机制，本研究通过WB检测了NF-κB通路相关蛋白的表达情况，结果显示，与NC-IKBKE组相比，si-IKBKE组的NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达水平均显著降低（F=139.206、55.551，均P=0.000），见图7。

图7 Western印迹检测KYSE-30细胞中NF-κB通路相关蛋白表达

3、讨论

ESCC作为临床常见的食管癌组织类型，其发生、发展过程可涉及多因素、多基因以及多通路的调控，但具体机制仍不完全明确。ESCC患者预后不佳，其术后5年的生存率低于50%，病死率较高[6]。因该病早期不易察觉，其浸润与转移是导致治疗失败及患者死亡的主要原因，因此，在早期ESCC制定特异性诊疗方案以及找出潜在治疗靶点对改善患者预后具有重要意义。近年来，随着学者不断的研究发现，蛋白激酶在肿瘤的诸多方面扮演着重要角色，并已成为临床治疗中的潜在靶点。其中，IKBKE又称IKKε、IKK-i，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是IKK激酶家族成员（IKKα、IKKβ、IKKγ、IKBKE、TBK1）之一。近年来的研究表明，IKBKE不单在炎症因子的激活、代谢性疾病以及细胞免疫的进展中发挥关键的调控作用，而且在多种恶性肿瘤的发生、发展中也发挥着重要作用[7]。研究表明，IKBKE导致肿瘤发生的有关机制为：（1)NF-κB通路是炎症免疫反应、细胞增殖、迁移与侵袭等重要调控者，IKBKE所组成的复合体是NF-κB通路激活的关键，其可经磷酸化IκB，消除IκB对NF-κB的抑制作用，使NF-κB入核，进而使与肿瘤发生、发展相关的NF-κB靶基因的转录过程被激活，促使疾病的进展。（2)IKBKE可激活AKT相关信号通路，如AKT/m TOR/S6K通路，促进肿瘤细胞增殖、迁移等。（3)IKBKE还可通过激活Hippo信号通路，增加该通路关键蛋白如Yes相关蛋白1(YAP1）和TEAD家族蛋白2(TEAD2）的表达，诱导上皮间充质转化过程，进而促进肿瘤细胞的侵袭、迁移等。（4)IKBKE还可通过磷酸化FOXO3a或Snail1转录因子，进而促进肿瘤的发生[3,8,9,10,11]。已有研究证实IKBKE在胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种癌组织中高表达，且与患者的预后密切相关[11,12,13]。而目前有关IKBKE在ES-CC表达及其相关机制研究鲜有报道。

本研究对比30例ESCC患者的癌组织及其癌旁组织中的IKBKE表达发现，ESCC组织中的IK-BKE的m RNA及蛋白表达水平均显著高于癌旁组织，说明IKBKE与ESCC的发生、发展有关。另外，本研究将IKBKE在组织中的表达水平与患者临床病理特征进行分析，结果显示，肿瘤分化程度越低、TNM分期越高以及肿瘤转移的ESCC患者，IKBKE的表达水平显著增加，说明IKBKE与ESCC的分化程度、TNM分期及其转移密切相关，提示IKBKE可能具有促进ESCC侵袭及转移的作用。余冬[14]研究显示，敲低IKBKE表达后，可有效降低胰腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭能力。郭高超[15]研究显示沉默IKBKE可有效抑制人胶质瘤细胞的增殖能力，且敲低IKBKE后可明显抑制小鼠颅内肿瘤生长，延长小鼠的生存时间。为进一步了解IKBKE对ESCC的生物学作用，本研究通过瞬时转染IKBKE-siRNA至KYSE-30细胞，经q RT-PCR及WB测定转染后细胞中IKBKE的表达，结果显示si-IKBKE组的IKBKE m RNA及蛋白表达水平均明显低于NC-IK-BKE组与空白对照组，说明转染效果较好，成功沉默KYSE-30细胞中IKBKE表达量。通过细胞增殖、迁移、划痕、侵袭以及凋亡实验检测IKBKE对ES-CC细胞的生物学行的影响，结果显示，si-IKBKE组的细胞增殖能力、细胞迁移能力均显著低于NC-IKBKE组，而其细胞侵袭抑制率、细胞凋亡率均明显高于NC-IKBKE组，说明沉默IKBKE表达可有效抑制ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力，促进细胞凋亡，有助于患者预后。

目前，关于IKBKE对ESCC作用的有关机制尚不清楚。既往研究表明，NF-κB通路的激活是导致多种肿瘤发生、发展的关键，而IKBKE被认为是促使NF-κB激活的重要效应因子[16]。正常情况下，NF-κB因子与IκB家族成员如IκB α、IκB β、IκB ε等滞留在细胞质中，形成复合物，导致NF-κB失活。而当肿瘤细胞微环境发生变化时，由IKKα、IKKβ和IKKγ组成的复合物可直接磷酸化IκB蛋白，使其泛素化降解，从而释放出NF-κB，使其进入细胞核，进而激活NF-κB通路。既往研究显示，IKBKE可通过上调磷酸化的IκB α的Ser-32、Ser-36位点，激活NF-κB通路[17]。郭彩丽[18]研究显示IKBKE可直接磷酸化p65，增强NF-κB活化，促进肿瘤细胞增殖。Guo等[19]指出IKBKE通过上调AKT/NF-κB信号通路，增强胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗耐药性。IKBKE还通过激活NF-κB信号通路，促进乳腺癌的发生和进展[20]。本研究通过WB检测NF-κB通路相关蛋白的表达情况，结果显示，si-IKBKE组细胞的NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达水平均显著低于NC-IKBKE组。说明沉默IKBKE可显著下调NF-κB通路蛋白的表达水平，提示下调IKBKE抑制ESCC细胞增殖、迁移、侵袭能力，促进细胞凋亡可能与通过调控NF-κB通路的分子机制有关。

综上所述，IKBKE参与ESCC的发生、发展，进一步的机制研究显示IKBKE可能通过调控NF-κB通路影响ESCC细胞的增殖、凋亡、迁移以及侵袭能力。IKBKE有望成为ESCC的治疗的新靶点、新方向。此外，针对IKBKE在ESCC其他细胞系或其体内相关分子机制研究将在后续的研究中开展。

参考文献:

[2]梁佳,吴璇,邝钢,等. lncRNA NUP50-AS1在食管鳞癌组织中的表达及其对Eca109细胞恶性生物学行为的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2018,25(12):1290-1295.

[5]黄璐,王凯,任玉峰. IKBKE在食管鳞癌中的表达及临床意义[J].中国中西医结合消化杂志,2019,27(2):101-105.

[14]余冬. IKBKE在胰腺癌中的表达及其对胰腺癌生物学行为的影响[D].天津医科大学,2020.

[15]郭高超. IKBKE通过磷酸化Amotl2促进YAP1的表达调控脑胶质瘤恶性进展的机制研究[D].天津医科大学,2020.

[16]李俊,余冬,孔德刚,等. IKBKE和NF-κB在胰腺癌中的表达及沉默IKBKE对胰腺癌细胞增殖､迁移的影响[J].中华肝胆外科杂志,2020,26(4):274-280.

[18]郭彩丽. IKBKE通过激活AKT/NF--KB信号通路调控胶质瘤的生长过程及增强胶质瘤的抗药性[D].河南:郑州大学,2019.

基金资助:河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20210706);

文章来源:王佳佳,王军,姜黄.IKBKE沉默对食管鳞癌细胞生物学行为的影响[J].天津医科大学学报,2024,30(04):316-322.