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TMEM119在乳腺肿瘤组织中的表达及其临床意义

2021-03-05 1010 上传者：管理员

摘要：目的:研究TMEM119在正常及乳腺良恶性肿瘤组织中的表达差异,探讨其在乳腺上皮肿瘤鉴别诊断及恶性肿瘤中的临床及预后价值。方法:利用cBioPortal下载TCGA乳腺癌基因表达谱资料及临床相关资料。免疫组化分析TMEM119在肿瘤组织及正常组织中的表达差异;进一步探讨TMEM119的表达差异与乳腺癌患者临床病理特征的相关性及其对预后的影响。结果:乳腺癌组织中的TMEM119表达明显高于配对的正常组织及良性肿瘤(P<0.01),TMEM119表达与肿瘤组织的淋巴结转移、远处转移、病理分期及预后相关(P<0.05)。结论:TMEM119可为良恶性肿瘤鉴别诊断、预测乳腺癌转移及判断预后的有效分子标记物,是影响患者预后的不良因素之一。

关键词：
TMEM119
乳腺癌
乳腺肿瘤
恶性肿瘤
鉴别诊断
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乳腺癌是来源于乳腺导管或小叶上皮的恶性肿瘤,是女性最常见的恶性肿瘤,同时也是女性恶性肿瘤死亡最常见原因之一。既往研究显示[1,2],全球乳腺癌新发病人数约280万及死亡人数约63万,新发病人数(11.6%)及死亡人数(6.6%)在恶性肿瘤中均为第二位。全国癌症登记中心数据显示,中国乳腺癌发病率仍呈持续上升趋势,乳腺癌为女性恶性肿瘤发病率的首位,病死率第五位,每年新发病约30.4万,因乳腺癌致死约7万[3]。乳腺癌患者不同的临床分期其5年生存率存在明显差异,Ⅰ-Ⅱ期患者5年总生存率>80%而Ⅲ-Ⅳ期总生存期迅速下降(22%～72%)[4]。因此,乳腺癌患者死亡的主要原因是由于肿瘤的转移和进展。从分子水平研究乳腺癌的发生发展机制,寻找新的肿瘤分子标记物,可为乳腺癌的诊治提供新的思路。

TMEM119在最初研究表明其在骨骼形成和正常骨骼矿化中起重要作用[5]。而近年来研究表明TMEM119可能在骨肉瘤、前列腺癌和胃癌等实体瘤中起到癌基因的作用[6,7,8,9]。既往虽然有研究应用基因芯片技术筛选鉴别乳腺良恶性肿瘤的研究发现,TMEM119基因可能在良恶性乳腺肿瘤中表达存在差异[10],但该研究并未将此基因表达进行进一步验证分析。其在乳腺良恶性肿瘤中的表达差异情况及其与临床病理资料的关系目前尚不明确。总之,目前没有TNEM119在乳腺肿瘤中表达及临床预后价值的研究。

本研究利用肿瘤基因组图谱(thecancergenomeatlas,TCGA)下载TMEM119基因表达谱资料及临床相关资料对比分析肿瘤组织及正常组织中TMEM119的表达差异,探讨其表达差异与乳腺癌患者临床病理特征的相关性及其对预后的影响。进一步应用免疫组化在本院乳腺癌随访队列中患者肿瘤病理切片中验证TMEM119表达与肿瘤临床病理预后特征的关系,为探索TMEM119在乳腺癌发生发展中的作用提供新的思路和线索。

1、材料与方法

1.1公共数据资料收集

利用cBioPortal数据库(www.cbioportal.org/)下载TCGA乳腺癌基因表达数据集,包含临床特征和生存信息等。符合入组条件乳腺癌肿瘤数据340例,正常组织数据32例为对照组。

1.2临床资料及病理切片

共收集乳腺癌患者肿瘤组织样本及癌旁正常乳腺组织73例,乳腺良性肿瘤及正常乳腺组织17例。所有患者均为2016年1月至2020年3月间初次于我院就诊、手术、放化疗及随访的乳腺癌病人,临床病理资料完整。病理诊断均由我院病理科的2名专家确认诊断。根据体格检查、B超和CT、MRI、骨扫描等影像学检查结果以及再次手术或穿刺活检明确有无临床复发及转移。总生存期为手术之日算起,随访结束点为患者死亡或最后一次随访时间(2020年9月6日)或失访时间。本研究获得所有患者同意并签署知情同意书,并通过我院医学伦理委员会批准。

1.3主要试剂与仪器

鼠抗人TMEM119抗体购自Proteintech生物技术有限公司(货号:66948-1-lg),HRP标记的山羊抗小鼠二抗检测试剂盒及浓缩型DAB检测试剂盒购自Servicebio生物技术有限公司(货号:GB23301)。

1.4免疫组织化学检测

石蜡切片置于60℃烤箱中1h,在二甲苯乙醇梯度脱蜡水化后,柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复,中火8min至沸,停火8min保温再转中低火7min,自然冷却后PBS洗涤3次,每次5min。加入3%双氧水溶液室温避光孵育25min后洗涤3次,3%BSA室温封闭30min,加入一抗鼠抗人TMEM119抗体,工作稀释比例为1∶500,4℃孵育过夜,PBS洗涤3次后再加入HRP标记的山羊抗小鼠于37℃孵育50min,PBS洗涤冲洗后DAB显色,苏木素复染3min左右,自来水冲洗,脱水,透明固定。免疫荧光检测TMEM119细胞定位。

1.5免疫荧光检测

抗原修复、封闭、一抗稀释比例1∶100孵育同前,避光条件下应用山羊抗小鼠FITC标记二抗,稀释比例为1∶100于37℃孵育50min,PBS洗涤冲洗后,DAPI复染30s后,荧光显微镜下观察,TMEM119细胞定位。

1.6染色结果判定

两位病理科医生独立阅片,染色评判方法为根据组织细胞的染色强度结合染色比例综合判断。阳性染色比例0～39%为0分;40%～79%为1分;≥80%为2分。根据染色强度计分:无染色颗粒为0分,黄色颗粒为1分,棕黄色颗粒为2分。最终结果取两者评分之和,0分为阴性,≥1分为阳性,0～1分为低表达,2～4分为高表达。

1.7统计学方法

数据分析使用SPSS21.0统计软件。TCGA基因表达数据中,定量资料采用t检验,定性资料采用卡方检验或Fisher确切概率法。免疫组化及临床病理资料中,使用配对McNemar检验分析对比正常组织和癌组织的基因表达差异,卡方检验或Fisher确切概率法分析乳腺癌组织与乳腺良性肿瘤中的表达差异以及进行分析蛋白表达与临床病理相关性。采用Kaplan-Meier法进行生存分析评估患者预后。采用Cox回归模型进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。统计作图应用GraphPadPrism8。

2、结果

2.1TMEM119在癌组织、良性肿瘤和正常组织中的表达差异分析

在TCGA基因表达芯片数据中,符合入组条件乳腺癌肿瘤数据340例,正常组织数据32例。肿瘤组织中的TMEM119表达明显高于正常组织(P=0.04,图1)。

在队列研究中,乳腺良性肿瘤患者平均年龄49.76岁(24～75岁);乳腺癌组患者平均年龄54.25岁(34～73岁)。乳腺癌中导管内原位癌4例,浸润性癌69例(导管癌38例,化生性癌1例,非特殊癌30例)。乳腺良性肿瘤中不典型增生8例,导管内乳头状瘤9例。乳腺癌组织中TMEM119高表达,而正常乳腺组织及良性肿瘤中低表达或阴性(图2)。乳腺癌组织与配对正常乳腺组织中TMEM119表达差异有统计学意义(P<0.001),乳腺癌组织与乳腺良性肿瘤中TMEM119表达差异有统计学意义(P<0.001)。乳腺恶性肿瘤中TMEM119在肿瘤细胞中均表达于细胞膜/细胞质中,部分肿瘤间质呈弱阳性(12/73)。

图1TCGA数据库mRNA-seq数据中乳腺癌组织及正常乳腺中TMEM119mRNA的表达

2.2TMEM119表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性分析

在TCGA乳腺癌基因表达芯片数据中,TEME119高表达在年龄≤45岁组与对照组间差异无统计学意义(P=0.261),基底亚型与非基底亚型间差异有统计学意义(P=0.001),在浸润性小叶癌与浸润性导管癌间表达差异有统计学意义(P<0.001),高肿瘤分期(P=0.011)及淋巴结转移(P=0.008)组间差异有统计学意义,高表达组与对照组间远处转移差异有统计学意义(P=0.021),但在不同T分期(Ⅰ/Ⅱ与Ⅲ/Ⅳ)之间差异没有统计学意义(P=0.43)。

在队列研究中,IHC染色显示TMEM119高表达在高临床肿瘤分期(P=0.002)、淋巴结转移组(P=0.001)及肿瘤三阴性亚型(P=0.042)与对照组之间差异有统计学意义,而在高龄、高T分期与对照组之间差异无统计学意义(表1)。

图2正常乳腺、乳腺良性肿瘤及乳腺癌组织中TMEM119蛋白表达

2.3TMEM119表达与乳腺癌患者预后的相关性分析

应用TCGA数据显示TMEM119高表达与对照组之间差异无统计学意义(P=0.0625,图3A)。在本队列研究获得随访的共有68例患者,随访率达93.15%。随访时间范围为4～38月,中位随访时间为18.13月。TMEM119高表达的乳腺癌患者有更差的预后(P=0.047,图3B),同时高Ki67(>80%)(P<0.001)与高肿瘤WHO分级(P=0.004)与预后差相关。而年龄(P=0.100)、临床肿瘤分级(P=0.553)不是预后因素。多因素COX分析中TMEM119高表达、高Ki67、高肿瘤分级均不是独立预后危险因素(P>0.05)。

3、讨论

TMEM119,mRNA大小852nt,包含3个外显子,编码283个氨基酸的Ia型跨膜蛋白。既往研究表明其在脑小胶质细胞、胆囊、淋巴结等21种组织中有表达[11,12]。在成骨细胞中TMEM119通过增强TGFβ-Smad3和PTH等相关信号通路促进成骨细胞分化[13,14,15],参与骨的形成和矿化并促进成骨细胞转化为骨细胞[16]。同时,TMEM119有可能参与局部免疫抑制[17]。在小胶质细胞中,TMEM19表达具有高度细胞特异性,是小胶质细胞可靠的标记物,其表达受到TGFβ信号通路的直接调控,通过与TMEM119启动子区的CTGTC序列结合促进TMEM119基因的转录。小胶质细胞参与多种中枢神经系统病变尤其是退行性病变,故在多种中枢神经系统病变中也发现TMEM119高表达。

图3TMEM119表达水平与乳腺癌总生存期的生存曲线

表1TMEM119与乳腺癌患者临床病理特征的关系

在肿瘤研究方面,基于基因芯片的前列腺癌研究中发现,高表达TMEM119与前列腺癌患者的总体生存率差相关[6]。同时,TMEM119在胃癌及骨肉瘤[7,8]中也有高表达。在骨肉瘤中,高表达TMEM119组比对照组有着更大的肿瘤直径、更高的肿瘤分期、更多的远处转移和更差的预后;高表达TMEM119与细胞周期、凋亡、转移和TGF-β信号传导等多个肿瘤相关的信号通路相关;细胞层面的研究显示,在敲低TMEM119表达后骨肉瘤细胞增殖明显受到抑制,出现G0/G1期阻滞,而且抗凋亡分子Bcl2表达水平显著降低和促凋亡分子caspase-8表达水平显著的增加,细胞迁移和侵袭显著增加,而TGF-β刺激因子暴露后显著促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭并挽救TMEM119siRNA的影响;动物实验同样显示TMEM119敲低组移植瘤重量显著低于对照组,故得出结论骨肉瘤细胞高表达TMEM119促进肿瘤增殖和迁移至少部分是依赖于TGF-β/BMP通路。在胃癌的研究中,TMEM119在胃癌组织和细胞系中高表达,高表达组患者生存率更短;TMEM119基因敲除后可抑制胃癌细胞系SGC-7901细胞的侵袭和迁移,同时抑制p-STAT3、VEGF、MMP2和MMP9等基因的表达,TMEM119高表达促进胃癌细胞系MKN45细胞的侵袭和迁移,同时促进p-STAT3、VEGF、MMP2和MMP9基因的表达。此外,PTK抑制物AG490治疗显著纠正了TMEM119诱导的MKN45细胞迁移和侵袭以及p-STAT3、VEGF、MMP9和MMP2等基因的表达。这表明TMEM119通过激活STAT3信号通路促进胃癌细胞迁移和侵袭。

本研究中利用TCGA数据库初步论证乳腺癌组织中的TMEM119表达高于其配对的正常组织;在乳腺癌中这种表达差异不受年龄、T分期的影响,而与乳腺癌亚型及肿瘤分期、淋巴结转移等相关。这进一步提示TMEM119在促进肿瘤进展中发挥作用。虽然关于TMEM119表达与预后的研究中,基于TCGA数据分析的结论与队列研究者中的结果不完全一致,结合既往研究分析,我们认为导致这一差异的原因可能是TCGA基因表达芯片数据仅提供的是高通量相对低精度的mRNA表达水平变化,具体承当生物学功能的蛋白表达还与蛋白降解、外排等多种生物学过程相关,可能无法完全代表TMEM119蛋白水平的表达情况。但TMEM119、Ki67或肿瘤分级等Kaplan-Meier分析中提示是预后因素的指标,在COX分析中均提示不是独立的预后因素,这提示上述因素间可能存在更深层次的相互作用机制。

综上所述,本研究表明TMEM119可成为乳腺肿瘤鉴别诊断及乳腺癌预后评价指标,并可能成为潜在的肿瘤标记物,为进一步研究TMEM119在乳腺癌的生物学功能提供依据。

参考文献：

[3]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.

丁小崇,任书伟,宋洋,杨长俊,蒋亚新.TMEM119在乳腺肿瘤组织中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2021,29(08):1324-1328.

基金:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(编号:202102310426)