肾细胞癌(RCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占美国所有新诊断癌症的4%和所有癌症死亡的2%[1,2]。根据组织学分类，60%～70%的RCC是肾透明细胞癌(ccRCC)[3]。ccRCC主要起源于肾小管上皮，发生于肾实质[4],其发病率逐年上升。早期ccRCC患者术后5年生存率为90%以上，中期患者5年生存率在80%左右，但对于晚期患者，生存率仅为20%左右[5,6]。因此，寻找新的发病机制对ccRCC的早期诊断和治疗非常重要。

环状RNA(circRNA)在前体RNA剪接后形成闭环，主要由蛋白质编码基因的外显子产生[7],由于其环状结构，circRNA具有较高的稳定性，可以存在于人细胞核中，避免被RNases降解[8]。作为调控RNA之一，circRNA可以促进基因转录[9]、调节选择性剪接[10]、抑制miRNA成熟[11]、促进蛋白质-蛋白质相互作用及miRNA海绵[12,13]。然而，关于circRNA在肾脏疾病，尤其是ccRCC中的研究尚为少见。

miRNA是小的非编码RNA,也负责mRNA功能的调节，许多miRNA已被证实在ccRCC进展中起关键作用[14,15]。但目前涉及ccRCC的miRNA和circRNA之间的特异性相互作用尚未充分讨论，深入了解miRNA及其潜在的circRNA调节因子对增殖、凋亡的影响可能有助于探究ccRCC靶向治疗。circRNA在基因表达调控中具有重要意义，通过文献报道发现circ-蛋白激酶B(AKT)3在RCC中发挥作用[16]。肾癌仍然缺乏简易、非侵袭性的早期诊断标志物，新近发现的miR-144、SOX2等为肾癌早期诊断生物标志物的研究提供了一个新领域。本研究基于miR-144-5p探讨circ-AKT3对ccRCC细胞增殖、凋亡的调控机制。

1、材料和方法

1.1细胞培养和转染

人肾皮质近曲小管上皮细胞系HK-2和ccRCC细胞系(Caki-1、786-O)均购自中国科学院(中国，上海),在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM、Gibco、Carlsbad, CA,美国)补充10%胎牛血清(FBS,Gibco),并在37℃ 下在含有5%CO2的培养箱中培养。

过表达circ-AKT3的慢病毒质粒由Geneseed(中国，广州)合成。慢病毒包装后48 h收集含有病毒的上清液，然后将其添加到ccRCC细胞(OSRC-2-荧光素酶，其稳定表达荧光素酶)。孵育24 h后，用购自Selleck(中国，上海)的2μg/ml嘌呤霉素2HCL选择稳定感染的细胞。细胞分组如下：Control组(未进行任何处理的786-O),oe NC组(在786-O转染空白质粒作为空白对照),oe circ-AKT3组(在786-O中转染过表达circ-AKT3的慢病毒质粒),oe circ-AKT3+mimic NC组(在过表达circ-AKT3的786-O中转染的mimic NC),oe circ-AKT3+mimic miR组(在过表达circ-AKT3的786-O中转染的mimic miR-144-3p)。按照操作说明书进行，转染48 h后进行后续实验。

1.2细胞凋亡检测

将不同处理组细胞接种至12孔板(8×104细胞/孔)中，48 h后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化并收集细胞，然后根据膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡试剂盒(上海碧云天，中国)说明书进行操作，最后用流式细胞仪(NovoCyte, ACEA Biosciences, San Diego, CA,美国)检测细胞凋亡情况。

1.3实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)

根据制造商的方案，使用Trizol溶液从肿瘤细胞中提取总RNA。使用反转录试剂盒将500 ng RNA反转录为cDNA。根据制造商的方案，在ABI73900系统(Applied Biosystems, Foster City, CA,美国)上使用实时荧光定量试剂盒进行qRT-PCR分析。将表达值标准化为GAPDH或U6,并使用2-ΔΔCt方法计算[17]。引物序列：circ-AKT3正向5′-TCCTTCCAGACAAAAGACCGT-3′,反向：5′-CGCTCATGATGACTCCCCTC-3′;GAPDH正向：5′-GTCAAGGCTGAGAA-CGGGAA-3′,反向：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′;miR-144-5p正向：5′-GCCGAGGGATATCATCATAT-3′;反向：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向：5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′。

1.4 RNA-FISH

为证实circ-AKT3是否可能通过海绵状miRNA发挥作用，通过RNA FISH实验检测circ-AKT3在786-O细胞中的亚细胞定位，Cy3标记的circ-AKT3探针由广州吉赛生物科技有限公司(中国，广州)设计和合成。BGC-823细胞在圆形盖玻片上生长，固定，在含0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲液(PBS)中透化并在乙醇中脱水。将FISH探针稀释(1∶50)、变性、平衡，并在37℃过夜添加到细胞中。杂交后，细胞在室温下用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的抗荧光淬灭封片液染色10 min,然后用橡胶水泥密封载玻片，并在黑暗中放置20 min以上[18]。最后，用TCS SP2 AOBS激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems,德国)观察结果。

1.5 RNA沉淀检测

根据制造商的方案，使用标记RNA探针3主要末端的脱硫生物素化试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,美国)用生物素(Biotin)标记RNA。然后将Biotin标记的野生型miR-144-5p和阴性对照(突变miR-144-5p)与细胞裂解物及磁珠一起孵育[19]。孵育6 h后，洗脱并提取珠上沉淀的RNA,然后进行qRT-PCR检测。

1.6双荧光素酶实验

Starbase数据库预测获得miR-144-5p与circ-AKT3或激活转录因子(ATF)2的结合位点。为了评估荧光素酶活性，使用786-O在达到70%融合率和1 h血清饥饿期后被转染到12孔板中。因ATF2对肿瘤细胞增殖、凋亡起调控作用[20],用0.5μg野生型或突变型circ-AKT3/ATF2质粒(Promega)和25 pmol miR-144-5p mimic或NC(GenePharma,使用Lipofectamine2000)共转染细胞。48 h后，收集细胞，然后使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega, WI,美国)根据提供的说明进行分析。

1.7统计学分析

采用SPSS21.0和GraphPad Prism8.01软件进行独立样本t检验、单因素方差分析或多因素方差分析、Tukey多重比较检验或Sidak多重比较检验。

2、结 果

2.1 circ-AKT3在ccRCC中低表达

qRT-PCR结果显示，circ-AKT3在Caki-1、786-O中mRNA表达水平(0.57±0.05、0.32±0.03)显著低于HK-2(1.00±0.02;均P<0.05),且circ-AKT3在786-O中mRNA表达水平最低，故选择786-O为后续的研究对象。

2.2 circ-AKT3对ccRCC细胞凋亡的影响

qRT-PCR结果显示，与Control组、ocNC组(0.32±0.03、0.35±0.03)相比，ccRCC细胞中经过表达circ-AKT3慢病毒质粒转染后，circ-AKT3水平(0.71±0.08)显著上升(均P<0.05),表明ccRCC细胞转染成功。与Control组、oeNC组相比，在ccRCC细胞过表达circ-AKT3显著促进细胞凋亡(P<0.05)。见图1、表1。表明circ-AKT3可促进ccRCC凋亡。

2.3 circ-AKT3充当miR-144-5p的海绵

RNA FISH实验结果发现，circ-AKT3主要分布在细胞质中(图2)。因此，推测circ-AKT3可能通过与细胞质中具有生物活性的其他多肽、蛋白质或核酸相互作用来影响ccRCC细胞行为。通过生物信息学网站(http: //starbase.sysu.edu.cn/index.php)预测发现，circ-AKT3与miR-144-5p存在相互作用位点(图3)。为进一步确认circ-AKT3和miR-144-5p之间的直接相互作用，使用786-O细胞裂解物对Biotin-miR-144-5p进行RNA pulldown测定结果显示，与Biotin-control(1.00±0.02)相比，Biotin-miR-144-5p显著富集了circ-AKT3表达(19.06±0.02,t=31.02、P<0.000 1)。此外，双荧光素酶实验结果显示，与其对照(0.90±0.05)相比，miR-144-5p模拟转染明显抑制了786-O中circ-AKT3 WT荧光素酶活性(0.35±0.02,P<0.001),而共转染miR-144-5p mimic和circ-AKT3 MUT组相对荧光素酶活性(0.87±0.04)与其对照(0.89±0.05)无显著性差异(P>0.05)。qRT-PCR结果显示，在ccRCC细胞中过表达circ-AKT3显著抑制786-O中miR-144-5p mRNA表达水平(P<0.05)。见表1。表明circ-AKT3充当miR-144-5p的海绵。

图1各组细胞凋亡

表1 circ-AKT3对ccRCC细胞凋亡及miR-144-5p mRNA表达的影响

2.4上调miR-144-5p的表达部分逆转高表达circ-AKT3对细胞行为的调控

qRT-PCR结果显示，在转染mimic miR-144-5p后，细胞miR-144-5p表达水平明显上升(P<0.05),提示转染成功。与单独转染过表达circ-AKT3质粒的786-O相比，在786-O同时过表达circ-AKT3和miR-144-5p显著抑制细胞凋亡(P<0.05)。见图1、表2。表明促进miR-144-5p表达部分逆转高表达circ-AKT3对细胞行为的调控。

2.5 circ-AKT3通过miR-144-5p/ATF2调控细胞行为

通过Starbase数据库展示miR-144-5p对ATF2的结合位点(图4),通过Starbase、Targetscan及miRDB数据库预测miR-144-5p下游靶基因取交集作为候选靶基因(图5)。采取双荧光素实验对miR-144-5p对ATF2的结合进行验证，结果显示共转染miR-144-5p mimic与ATF2 WT组相对荧光素酶活性(0.32±0.02)较其对照(0.89±0.04)显著降低(P<0.000 1),而共转染miR-144-5p mimic和ATF2 MUT组相对荧光素酶活性(0.89±0.04)与其对照(0.93±0.05)无显著性差异(P>0.05)。因而，推测circ-AKT3通过miR-144-5p/ATF2调控细胞行为。

图2 RNA FISH鉴定circ-AKT3在786-O细胞中的定位(×100)

图3 circ-AKT3与miR-144-5p存在相互作用位点

表2上调miR-144-5p的表达部分逆转高表达circ-AKT3对细胞行为的调控

图4 miR-144-5p与ATF2的相互作用位点

图5 Starbase、Targetscan及miRDB在线数据库预测miRNA靶基因交集

3、讨 论

circRNAs是各种生理和病理过程中的关键调节因子[21],越来越多的证据表明，circRNA表达与患者的临床特征密切相关，其异常表达往往会导致恶性行为，如增殖和转移[21]。因此，确定circRNA与肿瘤行为之间的关系至关重要。考虑到circRNA在RCC中的研究尚少。

circRNAs参与各种病理过程，包括细胞凋亡、增殖和侵袭[22]。如hsa_circ_0001649敲低可调节胆管癌恶性行为[23],circNDUFB2通过破坏胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)和激活抗肿瘤免疫抑制非小细胞肺癌进展[24]。此外，hsa_circ_001783作为miR-200c-3p的海绵可促进乳腺癌细胞的进展[25]。miR-144-5p曾被研究报道可能是ccRCC预后的潜在生物标志物[26],本文验证了ccRCC细胞中circ-AKT3和miR-144-5p之间的关联，且circ-AKT3过表达显著抑制786-O中miR-144-5p表达水平。

miRNA通过与目标mRNA的3′-UTR结合发挥作用[27],有研究指出，miR-144-5p/环指蛋白(RNF)187轴的失调有助于结直肠癌的进展[28],miR-144/451簇通过抑制细胞侵袭在食管癌中发挥原癌基因作用[29]。ATF2是激活蛋白(AP)1转录因子家族的成员，通过家族成员(如Jun和Fos)内的同源或异源二聚化发挥作用[30]。其已被表征为不仅是细胞对刺激(如压力)反应的介质，而且是几种类型肿瘤的肿瘤发生和进展的介质，ATF2对肿瘤细胞增殖、凋亡起调控作用[20]。本研究通过生物信息学分析预测miR-144-5p可能靶向ATF2,通过一系列实验验证了它们之间的直接相互作用，但尚未深入探究miR-144-5p/ATF2对细胞行为的调控。SOX2基因在癌症发生中具有抑制凋亡、促进血管生成、侵袭性行为等功效和作用，后期可探讨circ-AKT3能够通过miR-144-5p/SOX2调控肾癌细胞的生物学行为，为circAKT3是否作为肾癌细胞治疗新靶点提供参考依据。

在未来的研究中，将着重研究circ-AKT3/miR-144-5p/ATF2调控细胞行为更为具体的机制，并且考虑该机制是否存在于多种肾癌细胞中。

参考文献:

1刘威,喻春钊,杨健,等.终末期肾病相关性肾细胞癌的研究进展[J].中国医药导报,2022;19(15):45-7.

5胡芳芳.肾透明细胞癌KLF2表达水平与患者预后的相关性研究[D].合肥:安徽医科大学,2022.

基金资助:河北省医学科学研究课题计划项目(20220452);

文章来源:王晓玲,孟莉丹,王学敏,等.circ-AKT3对肾透明细胞癌细胞凋亡的调控机制[J].中国老年学杂志,2024,44(20):5059-5063.