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青蒿琥酯抑制肾母细胞瘤细胞系SK-NEP-1增殖和促进凋亡与自噬

2025-03-27 55 上传者：管理员

摘要：目的探讨青蒿琥酯(Art)对肾母细胞瘤细胞系(SK-NEP-1)增殖､凋亡和自噬的影响｡方法以不同浓度的Art(0､10､20､40和80μmol/L)干预SK-NEP-1细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,筛选最佳干预浓度;将SK-NEP-1细胞分为对照组､Art组､3-MA组(Art+自噬抑制剂,3-甲基腺嘌呤)､Rapa组(Art+自噬激活剂雷帕霉素),EdU､流式细胞测量术分别检测细胞增殖､凋亡;丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测细胞自噬;DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(ROS)的水平;Western blot检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)､细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)､Bcl-2相关X蛋白(Bax)､微管连接蛋白1轻链3Ⅱ/3Ⅰ(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)､选择性自噬接头蛋白1(p62)和Beclin-1蛋白表达｡结果与0μmol/L Art相比,10､20､40和80μmol/L Art处理后SK-NEP-1细胞增殖抑制率逐渐升高(P<0.05),IC50值为46.881μmol/L,故选取40μmol/L Art进行后续实验｡与对照组相比,Art组SK-NEP-1细胞凋亡率､相对自噬荧光强度､ROS水平､Bax､LC3Ⅱ/LC3Ⅰ､Beclin-1､PINK1､Parkin蛋白表达水平显著升高,EdU阳性细胞率､PCNA､Bcl-2､p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05);自噬抑制剂3-MA可减弱Art对肾母细胞瘤细胞凋亡和自噬的促进作用,对增殖的抑制作用(P<0.05)｡结论 Art抑制肾母细胞瘤细胞系的增殖,促进细胞自噬和凋亡｡

关键词：
凋亡
增殖
肾母细胞瘤
自噬
青蒿琥酯
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肾母细胞瘤是儿童年龄段最常见的肾癌,其标准化治疗包括手术和化疗相结合,高危患者加放疗,预后通常良好,然而,晚期肿瘤患儿的结局仍然很差[1]｡因此对肾母细胞瘤发病机制进行全面研究,对开发新的治疗药物具有重要意义｡青蒿琥酯( artesunate,Art)是从中药青蒿中提取的一种水溶性衍生物,具有抗肿瘤活性,Art促进活性氧( reactive oxygen species,ROS)依赖性细胞衰老和自噬来抑制结直肠癌细胞增殖[2]｡Art通过抑制STAT3信号转导诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的凋亡､自噬和铁死亡[3]｡Art抑制肾母细胞瘤增殖并促进自噬[4]｡而Art对肾母细胞瘤细胞增殖､凋亡和自噬的影响和机制研究仍尚少｡故本研究探讨Art对肾母细胞瘤细胞凋亡､增殖和自噬的作用及可能机制,为肾母细胞瘤的治疗策略提供新的视角｡

1、材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1细胞来源:

人源肾母细胞瘤细胞系SK⁃NEP⁃1(中国科学院细胞所)｡

1. 1. 2主要试剂:

青蒿琥酯(纯度99%,南京赛泓瑞生物科技有限公司);自噬抑制剂3⁃甲基腺嘌呤(3⁃MA)(上海博尔森生物科技有限公司);自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和EdU染色试剂盒(上海吉至生化科技有限公司);细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法) (上海梵态生物公司);DCFH⁃DA荧光探针(上海圻明生物科技有限公司);兔源一抗增殖细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen,PCNA)､B淋巴细胞瘤⁃2 ( B cell lymphomatoma⁃2,Bcl⁃2)､Bcl⁃2相关X蛋白( Bcl⁃2 associated X pro⁃tein, Bax )､Beclin⁃1､选择性自噬接头蛋白1(selective autophagy junction protein 1,p62)､微管连接蛋白1轻链3(microtubule junction protein 1 lightchain 3,LC3)Ⅰ､LC3Ⅱ､GAPDH､辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗IgG(Abcam公司)｡

1. 2方法

1. 2. 1 MTT法测定细胞增殖:

将SK⁃NEP⁃1细胞接种至96孔板(1×104个/孔),分别添加含0､10､20､40､80 μmol / L Art[5]的培养液,48 h后各添加MTT溶液20 μL,4 h后添加二甲基亚砜150 μL,混匀后,用酶标仪测定490 nm的吸光度值,并计算增殖抑制率(%)｡实验重复3次,设6重复孔｡

1. 2. 2细胞及分组和药物处理:

将SK⁃NEP⁃1细胞分为对照( control)组､Art组( 40 μmol / L Art干预48 h),48 h后用､3⁃MA组(Art+自噬抑制剂3⁃MA,40 μmol / L Art干预48 h后用2. 5 mmol / L 3⁃MA[6]干预)和Rapa组( Art +自噬激活剂雷帕霉素,40 μmol / L Art干预48 h后用250 nmol / L雷帕霉素[7]干预)｡

1. 2. 3 EdU染色测定细胞增殖:

SK⁃NEP⁃1细胞接种于96孔板(1×103个/孔)｡孵育18 h后,弃去培养基,换成含不同浓度Art的新鲜培养基或二甲基亚砜作为溶剂｡24 h后,添加含EdU(50 μmol / L)的培养基100 μL,孵育4 h｡用4 %多聚甲醛固定细胞30 min,室温下用DAPI孵育30 min｡在共聚焦显微镜下观察EdU阳性细胞｡

1. 2. 4流式细胞测量术分析细胞凋亡:

使用annexin V⁃FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡｡收集对数期的各组细胞,用冰冷的PBS洗涤2次,并使用流式细胞仪在结合缓冲液中用annexinV⁃FITC和PI染色2 min来分析细胞凋亡｡

1. 2. 5 MDC染色法检测细胞自噬:

SK⁃NEP⁃1细胞在24孔板的盖玻片上培养48 h,弃去培养基｡用缓冲液漂洗细胞后,加入100 μL MDC(50 μmol / L),避光45 min｡细胞洗涤两次后,用4 %多聚甲醛固定15 min,荧光显微镜下观察拍照｡采用Image⁃ProPlus软件分析自噬荧光强度｡

1. 2. 6 DCFH⁃DA荧光探针检测ROS水平:

将SK⁃NEP⁃1细胞接种在细胞培养皿上并培养过夜,用DCFH⁃DA染色对细胞进行染色30 min,并在共聚焦激光显微镜下捕获荧光｡Image⁃Pro Plus软件分析荧光强度｡

1. 2. 7 Western blot检测增殖､凋亡和自噬蛋白质表达:

用RIPA裂解缓冲液提取组织和细胞总蛋白质｡用BCA试剂盒测定蛋白质浓度,用SDS⁃PAGE分离蛋白质,并将其转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶阻断分离膜1 h｡与Bcl⁃2 ( 1∶2 000)､PCNA(1∶1 000)､Bax(1∶2 000)､Beclin⁃1(1∶1 000)､LC3Ⅱ(1∶1 000)､LC3Ⅰ(1∶1 000)､p62 (1∶1 000)､GAPDH(1∶2 500)一抗4℃过夜孵育,用羊抗兔IgG(1∶500)二抗再孵育1 h｡利用ECL试剂对条带进行可视化,并用ImageJ进行定量｡

1. 3统计学分析

计量资料以均数±标准差x ±s)表示,以SPSS22. 0软件统计分析,多组间比较用单因素方差分析和SNK⁃q检验｡

2、结果

2. 1 Art对SK⁃NEP⁃1细胞的增殖抑制情况

与0 μmol / L Art相比,10､20､40和80 μmol / LArt SK⁃NEP⁃1细胞增殖抑制率逐渐升高(9. 27% ±1. 3%､22. 69% ±2. 69%､41. 35% ±2. 73%､68. 27% ±3. 28%),Art以浓度依赖性的方式抑制SK⁃NEP⁃1细胞增殖(P<0. 05),IC50值为46. 881 μmol / L,因此本研究选取40 μmol / L Art进行后续实验｡

2. 2 Art对SK⁃NEP⁃1细胞增殖能力的影响

与对照组相比,Art组EdU阳性细胞率下降(P<0. 05);与Art组相比,3⁃MA组EdU阳性细胞率增加(P<0. 05)(图1)｡2. 3 Art对SK⁃NEP⁃1细胞凋亡的影响与对照组相比,Art组SK⁃NEP⁃1细胞凋亡率增加(P<0. 05);与Art组相比,3⁃MA组细胞凋亡率下降(P<0. 05)(图2)｡

图1 EdU测定各组SK⁃NEP⁃1细胞增殖

2. 4 Art对SK⁃NEP⁃1细胞自噬的影响

与对照组相比,Art组SK⁃NEP⁃1细胞相对自噬荧光强度显著升高(P<0. 05);与Art组相比,3⁃MA组SK⁃NEP⁃1细胞相对自噬荧光强度显著降低(P<0. 05)(图3)｡

2. 5 Art对SK⁃NEP⁃1细胞中ROS水平的影响

与对照组相比,Art组SK⁃NEP⁃1细胞ROS水平显著升高( P < 0. 05);与Art组相比,3⁃MA组SK⁃NEP⁃1细胞ROS水平显著降低(P<0. 05)(图4)｡

2. 6 Art对增殖､凋亡､自噬及PINK1､Parkin蛋白表达的影响

与对照组相比,Art组SK⁃NEP⁃1细胞中Bax､LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ､Beclin⁃1蛋白水平上调, PCNA､Bcl⁃2､P62水平下调(P<0. 05);与Art组相比,3⁃MA组SK⁃NEP⁃1细胞Bax､LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ､Beclin⁃1下调,PCNA､Bcl⁃2､P62水平上调(P<0. 05)(图5)｡

图2流式细胞测量术检细胞凋亡

图3荧光显微镜观察SK⁃NEP⁃1细胞自噬

图4 DCFH⁃DA荧光探针检测SK⁃NEP⁃1细胞中ROS水平

图5 Western blot检测SK⁃NEP⁃1细胞中增殖､凋亡和自噬蛋白质表达

3、讨论

自噬被过度激活可引起癌细胞程序性死亡,研究表明抑制细胞增殖,调控自噬､凋亡已成为肿瘤治疗的重要手段[8⁃9]｡因此,研究肾母细胞瘤细胞增殖､自噬､凋亡的分子机制对于肾母细胞瘤的治疗具有重要意义｡

Art是青蒿素的衍生物,具有抗炎､抗氧化应激､抗疟疾､抗肿瘤等多种生物活性[10]｡Art通过激活青蒿琥酯激活ATF4 / CHOP通路,抑制对胃癌细胞增殖,促进凋亡和自噬,发挥抗胃癌的作用[6]｡Art联合二甲双胍通过激活ROS⁃AMPK⁃mTOR轴,诱导的胶质母细胞瘤自噬依赖性凋亡[11]｡此外,已经在结直肠癌､前列腺癌和乳腺癌中进行了几项临床试验,证明Art具有抗肿瘤特性,且耐受性良好[12]｡本研究使用Art干预SK⁃NEP⁃1细胞发现,Art能够抑制SK⁃NEP⁃1细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬｡

线粒体产生的ROS已被证明调节癌细胞增殖方面起着至关重要的作用,ROS积累增强了线粒体损伤,导致肿瘤细胞的自噬激活并显著增强癌细胞的凋亡[13]｡ROS诱导自噬,促进细胞凋亡是肾母细胞瘤细胞死亡的最重要机制｡PCNA是反映细胞增殖水平的标志物,Bax是细胞凋亡的关键调节因子,Beclin⁃1是自噬的主要调节因子,LC3Ⅱ/Ⅰ比值是早期自噬活性的指标,p62是一种多功能接头蛋白,与凋亡和自噬过程有关[14]｡本研究中,Art干预后,SK⁃NEP⁃1细胞中增殖蛋白PCNA､抗凋亡､抗自噬蛋白Bcl⁃2､p62表达水平降低,ROS水平､凋亡蛋白Bax及自噬蛋白LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ､Beclin⁃1水平升高,与细胞表型一致｡这些结果提示,Art可通过调节标志蛋白水平抑制SK⁃NEP⁃1细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,具有抗肾母细胞瘤的作用｡

为进一步验证自噬与凋亡的关系,本研究用Art和自噬激活剂或抑制剂分别联合,结果显示,Art和自噬激活剂雷帕霉素干预后,SK⁃NEP⁃1细胞增殖､凋亡､自噬及相关蛋白表达的差异没有统计学意义;而自噬抑制剂3⁃甲基腺嘌呤干预减弱了Art对肾母细胞瘤细胞凋亡和自噬的促进作用,对增殖的抑制作用｡

综上所述,Art抑制肾母细胞瘤细胞系增殖,促进细胞自噬和凋亡｡

参考文献:

[4]闫向英,毛霞,李涛,等.基于DNA甲基化测序技术研究青蒿琥酯干预脑胶质瘤的分子机制[ J] .中草药, 2023, 54:1814⁃1824.

[6]马立东,刘晓蕾,赵飞.青蒿琥酯激活ATF4 / CHOP通路对人胃癌细胞增殖､凋亡和自噬的影响[J].中国药师, 2022, 25:1884⁃1888.

[7]刘艳,孙健.左金丸调控AMPK/ mTOR通路介导的自噬途径逆转胃癌耐药机制研究[ J].重庆医学, 2022,51:6⁃11.

[14]高朋,徐丹丹,张斌,等.氯喹对人宫颈癌细胞系HeLa增殖､凋亡及自噬的影响[ J].基础医学与临床,2023, 43:1512⁃1517.

基金资助:河北省2024年度中医药类科学研究课题计划项目(2024195);

文章来源:魏建新,房彦乐,鲁雨博,等.青蒿琥酯抑制肾母细胞瘤细胞系SK-NEP-1增殖和促进凋亡与自噬[J].基础医学与临床,2025,45(04):493-498.