肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于肾实质上皮系统的恶性肿瘤[1-2]。RCC在组织学上分为多种亚型，其中以透明细胞RCC最为常见[3-4]。RCC具有高复发率和高转移率等特点，给社会和患者家庭带来了巨大的负担[4]。RCC的治疗方法主要有手术、放疗和化疗，但多数患者起病隐匿、症状出现较晚，给治疗带来很大困难[5]。我国国家癌症中心发布的中国恶性肿瘤疾病负担报告显示，2022年我国有7.37万例新发RCC病例，有2.4万例患者因RCC死亡[6]。约30%的RCC患者在肿瘤切除后会发生远处转移，5年生存率低于20%[7-8]。因此，寻找RCC早期诊断和预后评估的分子指标是及早治疗、提高患者生存率的重要方法之一。

翻译控制肿瘤蛋白1(translationally-controlled tumor protein 1，TPT1)是一种高度保守的蛋白质，在多种人类肿瘤中异常表达，参与肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的调控[9-11]。例如，miRNA-216a-5p通过靶向TPT1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白1轴抑制胰腺癌的进展[12]；lncRNA TPT1-反义RNA1通过上调TPT1表达促进上皮性卵巢癌的发生[13]。然而，TPT1在RCC中的作用在很大程度上仍不清楚。

本研究探讨了TPT1在RCC组织中的表达水平及其临床意义，还通过功能缺失实验验证了TPT1在人RCC细胞中的生物学功能，旨在为RCC的诊断和治疗提供新的策略。

1、材料和方法

1.1 差异表达基因的筛选

从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)下载微阵列数据集GSE15641(包括23例正常肾脏组织样本数据和32例RCC组织样本数据)，用R 4.3.0软件的preprocessCore包和limma包分别进行数据标准化处理和去除批次效应。采用箱线图评估数据标准化情况，通过主成分分析(principal component analysis，PCA)方法评估数据批次效应情况。使用R 4.3.0软件的limma包分析TPT1的差异表达情况，筛选条件为P<0.05且|log2(FC)|>1(FC为差异倍数)。

1.2 RCC患者数据下载及分组

从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库下载RCC患者的临床信息和TPT1表达数据，共获得522例RCC患者数据。按照TPT1表达中位数(1.495)将患者分为TPT1高表达组(TPT1表达水平≥1.495)和TPT1低表达组(TPT1表达水平<1.495)，每组261例。采用在线工具OncoLnc进行数据分析。

1.3 实验试剂

RCC细胞(人肾细胞腺癌细胞769-P、人肾透明细胞腺癌细胞786-O、人肾细胞腺癌细胞ACHN和人肾透明细胞癌皮肤转移细胞Caki-1)和人正常胚肾293细胞(HEK293)均购自美国ATCC。TPT1抑制剂(TPT1 siRNA-1、TPT1 siRNA-2)、siRNA阴性对照(negative control，NC)购自上海吉玛生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine®2000、TRIzol试剂、MaximaTMSYBR Green qPCR预混液均购自美国ThermoFisher Scientific公司。RPMI 1640培养基(适用769-P、786-O细胞)、DMEM(适用ACHN、HEK293细胞)、McCoy’s 5a培养基(适用Caki-1细胞)、FBS及胰蛋白酶购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合溶液购自美国Sigma公司；PrimeScriptTM反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；GAPDH、TPT1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein，Bax)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)抗体及HRP标记的二抗均购自英国Abcam公司；CCK-8购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 组织样本的获取

取2013年9月至2022年1月在南通大学附属医院确诊并接受治疗的90例RCC患者的RCC组织及癌旁正常组织(距离肿瘤病灶2 cm)，保存在-80 ℃备用。本研究通过南通大学附属医院伦理委员会审批(2022-K138-01)。

1.5 细胞培养和转染

RCC细胞和HEK293细胞用含有10% FBS及100 U/mL青霉素-链霉素的培养基于37 ℃ 5% CO2恒温培养箱中培养，待细胞密度达约80%时用0.25%胰蛋白酶消化传代。将细胞接种于6孔板内，待细胞密度达50%～60%时更换成无血清培养基，分别将TPT1 siRNA-1、TPT1 siRNA-2和siRNA NC转染到细胞中，同时设置空白对照。TPT1 siRNA-1正义链序列为5'-UGUUCAAGGUCUAUCAGUGGA-3'，反义链序列为5'-CACUGAUAGACCUUGAACAAU-3'；TPT1 siRNA-2正义链序列为5'-AUUGUUCAA-GGUCUAUCAGUG-3'，反义链序列为5'-CUGA-UAGACCUUGAACAAUUU-3'；siRNA NC正义链序列为5'-GACUUCAUAAGGCGCAUGCUU-3'，反义链序列为5'-GCAUGCGCCUUAUGAAGUC-UU-3'。

1.6 qPCR实验

使用TRIzol试剂分别从RCC组织和细胞中提取总RNA，用PrimeScriptTM反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以GAPDH作为内参，采用MaximaTMSYBR Green qPCR预混液进行PCR扩增。反应体系：2×qPCR预混液12.5 μL、7.5 μmol/L正义和反义引物各1.0 μL、cDNA 2.5 μL、ddH2O 8.0 μL。反应条件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s(变性)、55 ℃ 30 s(退火)、70 ℃ 30 s(延伸)，共40个循环。TPT1正向引物序列为5'-AGCC-ACAGTGAGATGTTCTCT-3'，反向引物序列为5'-CAGCCCGTCTGCAATTTCCT-3'；GAPDH正向引物序列为5'-TGTGGGCATCAATGGATTT-GG-3'，反向引物序列为5'-ACACCATGTATTCCG-GGTCAAT-3'。采用2-∆∆Ct法进行半定量分析。

1.7 蛋白质印迹法分析

细胞转染后，向每孔细胞中加入蛋白质裂解液提取总蛋白质，并经沸水煮10 min变性。蛋白质样品通过SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白溶液封闭2 h，用TBST洗PVDF膜3次后过夜孵育一抗(稀释比例均为1∶1 000)，然后用TBST洗涤PVDF膜3次后室温孵育相应二抗(稀释比例均为1∶5 000)。于避光环境中进行ECL显影并拍照，利用ImageJ软件进行光密度分析，最终结果表示为目的蛋白质条带与内参条带的光密度比值。

1.8 CCK-8检测

将转染后的细胞按照每孔1×104个的密度接种到96孔板中培养，在0、24、48、72 h时分别取样并加入CCK-8试剂，继续培养4 h，使用酶标仪测定波长450 nm处的光密度值。

1.9 划痕实验

细胞常规培养至形成单层细胞，用灭菌的100 μL黄色Tip枪头划一条直线，形成无细胞生长区域(即划痕)，并记录划痕区面积。随后将细胞置于恒温培养箱中培养，分别在0、24 h时用PBS洗去划落的细胞，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.10 Transwell实验

将100 μL的Matrigel稀释液均匀涂于Transwell包被小室底部基底膜，往小室外加入含10% FBS的培养基900 μL，每个小室内接种细胞数约为1×105个，常规培养24 h。取出Transwell小室，用PBS洗涤，加入4%多聚甲醛溶液固定。然后用结晶紫染液染色，在光学显微镜下观察、拍照，每组随机选取5个视野计数细胞。

1.11 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料若呈正态分布以

±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；若呈偏态分布则以中位数表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。应用在线工具OncoLnc，采用ROC曲线分析TPT1在RCC诊断中的价值，采用Kaplan-Meier生存曲线分析TPT1在RCC预后预测中的价值。检验水准(α)为0.05。

2、结 果

2.1 生物信息学分析

差异表达基因分析结果表明，与正常肾脏组织相比，TPT1在RCC组织中表达上调(P<0.000 1，log2(FC)为5 438.821，图1)。京都基因与基因组百科全书通路富集分析结果显示，TPT1在MAPK信号通路和神经活性配体-受体相互作用中显著富集。基因本体功能富集分析结果表明，TPT1在小分子分解代谢过程中显著富集。

图1微阵列数据集GSE15641中RCC与正常肾脏组织的差异表达基因分析

2.2 TPT1在RCC组织中的表达及其与RCC患者临床病理特征的关系

对南通大学附属医院的90例RCC患者组织样本的qPCR检测结果显示，与癌旁正常组织相比，RCC组织中TPT1mRNA表达增高(P<0.01，图2A)。蛋白质印迹法检测结果显示，TPT1在RCC组织中的表达量为1.474±0.094，在癌旁正常组织中的表达量为0.910±0.088，差异有统计学意义(P<0.01，图2B)。根据TPT1蛋白表达平均值将RCC患者分为TPT1高表达(TPT1蛋白表达水平≥1.474，39例)与低表达(<1.474，51例)组，采用χ2检验分析TPT1表达与RCC患者临床病理特征的关系，结果显示，TPT1表达水平与RCC患者年龄、性别、肿瘤分化程度无关，但TPT1表达水平低的RCC患者肿瘤大小及转移发生率均低于TPT1表达水平高的患者(P=0.048、0.017)。见表1。

2.3 TPT1在RCC诊断及预后中的价值

对TCGA数据库中522例RCC患者的临床信息及TPT1表达情况进行ROC曲线分析，结果显示，TPT1对RCC具有较高的诊断价值(AUC=0.856 9，95%CI0.804 5～0.909 3，P<0.001，图3A)。采用Kaplan-Meier生存曲线分析TPT1在RCC中的预后价值，结果表明低TPT1表达组RCC患者的总生存期长于高TPT1表达组(P=0.018 4，图3B)。

图2TPT1在RCC组织中的表达情况

表1不同TPT1表达水平RCC患者的临床病理特征分析

图3 TPT1在RCC诊断及预后评估中的价值

2.4 TPT1在RCC细胞中表达上调

qPCR检测结果显示，与HEK293相比，RCC细胞株769-P、786-O、ACHN和Caki-1细胞中TPT1mRNA的表达均上调(P<0.05或P<0.01)，见图4。

2.5 TPT1 siRNA转染效率的验证

qPCR检测结果显示，空白对照组和siRNA NC组HEK293细胞中TPT1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与siRNA NC组相比，HEK293细胞转染TPT1 siRNA-1和TPT1 siRNA-2后TPT1mRNA表达均下调(P<0.05或P<0.01，图5A)，说明TPT1 siRNA-1和TPT1 siRNA-2均转染成功。两者相比TPT1 siRNA-2对TPT1表达的干扰效果更好，因此选择TPT1 siRNA-2进行后续实验。与siRNA NC组相比，将TPT1 siRNA-2转染到786-O和Caki-1细胞后TPT1mRNA表达量分别降低(64.89±6.14)%、(63.90±5.41)%，差异均有统计学意义(P均<0.01)。蛋白质印迹法检测结果显示，TPT1 siRNA-2和siRNA NC组786-O细胞中TPT1蛋白的表达量分别为0.835±0.038和1.032±0.004，Caki-1细胞中TPT1蛋白的表达量分别为1.190±0.040和1.461±0.031，差异均有统计学意义(均P<0.01，图5B)。

图4 TPT1在正常人胚肾细胞HEK293和RCC细胞（769-P、786-O、ACHN和Caki-1）中的表达

图5 TPT1干扰效率验证结果

2.6 TPT1对RCC细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，与siRNA NC组相比，在TPT1 siRNA-2转染48 h和72 h后786-O和Caki-1细胞的增殖活力均降低（均P<0.01，图6），表明抑制TPT1表达能降低RCC细胞的增殖能力。

图6 CCK-8法分析TPT1对RCC细胞786-O(A）和Caki-1(B）增殖活力的影响

2.7 TPT1对RCC细胞迁移的影响

划痕实验结果显示，siRNA NC组786-O细胞在24 h后划痕面积缩小到原来的(26.52±1.98)%，TPT1 siRNA-2组划痕面积缩小到原来的(55.41±0.29)%；siRNA NC组Caki-1细胞在24 h后划痕面积缩小到原来的(56.72±5.28)%，TPT1 siRNA-2组划痕面积缩小到原来的(72.81±0.39)%。与siRNA NC组相比，转染TPT1 siRNA-2后786-O及Caki-1细胞的迁移能力均降低(P均<0.01)。见图7。

2.8 TPT1对RCC细胞侵袭的影响

Transwell实验结果显示，TPT1 siRNA-2组786-O细胞的侵袭细胞数为(114±5)个，少于siRNA NC组的(417±4)个(P<0.01)；TPT1 siRNA-2组Caki-1细胞的侵袭细胞数为(99±4)个，少于siRNA NC组的(412±3)个(P<0.01)，表明转染TPT1 siRNA-2后786-O及Caki-1细胞的侵袭能力均降低。见图8。

2.9 TPT1对RCC细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，siRNA NC组786-O细胞Bcl-2、Bax、MMP9的表达量分别为0.998±0.002、0.402±0.019和1.339±0.054，TPT1 siRNA-2组分别为0.923±0.028、0.678±0.016和0.795±0.015；siRNA NC组Caki-1细胞Bcl-2、Bax、MMP9的表达量分别为1.230±0.044、0.288±0.014和0.842±0.022，TPT1 siRNA-2组分别为0.952±0.017、1.043±0.006和0.663±0.026。与siRNA NC组相比，转染TPT1 siRNA-2后786-O及Caki-1细胞中Bcl-2、MMP9蛋白表达均降低，而Bax蛋白表达均增加(P<0.05或P<0.01)，说明抑制TPT1表达能增强RCC细胞的凋亡能力。见图9。

图7 划痕实验验证抑制TPT1表达后RCC细胞786-O(A）及Caki-1(B）迁移能力的变化（200×）

图8 Transwell实验验证TPT1对RCC细胞7 8 6-O及Caki-1侵袭能力的影响（200×）

3、讨 论

图9蛋白质印迹法检测抑制TPT1表达后RCC细胞786-O和Caki-1中的Bcl-2、Bax、MMP9蛋白表达情况

RCC的病因包括遗传改变、染色体不稳定性及生长因子通路激活等[1]。为了明确TPT1在RCC中的病理作用，本研究评估了TPT1在RCC组织和细胞中的表达情况。本研究结果显示在RCC组织中TPT1表达上调，TPT1表达水平低的RCC患者总生存期比TPT1表达水平高的RCC患者长，而且肿瘤大小和转移发生率均低于TPT1表达水平高的患者，说明TPT1可能在RCC中发挥促肿瘤作用。

本研究结果与以往在多种肿瘤中的研究结果一致，即TPT1表现为促肿瘤基因，如Sun等[17]报道TPT1在结直肠癌中能够促进肿瘤细胞增殖和细胞分裂，Zhu等[18]研究报道TPT1表达增强与宫颈癌进展相关。本研究结果显示，TPT1在RCC组织和细胞中表达上调，干扰TPT1表达可抑制RCC细胞的体外增殖、迁移和侵袭，并增强其凋亡，表明TPT1可能是RCC潜在的治疗靶点。

文章来源:王庆卿,黄新忠,胡崟钰,等.翻译控制肿瘤蛋白1调控肾细胞癌细胞增殖迁移的机制[J].海军军医大学学报,2024,45(12):1521-1528.