代谢重编程在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，在肾癌代谢中的改变尤其明显。肾癌是泌尿系统常见肿瘤之一，其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是最常见的亚型，约占所有肾癌病理类型的70%～80%[1]。晚期ccRCC主要以分子靶向治疗为主，但目前发现该肾癌类型容易对靶向治疗产生耐药，导致治疗效果不理想[2,3,4]。有研究发现肿瘤代谢产物在恶性肿瘤进展和耐药中发挥重要作用[5]。在肿瘤发生发展中，代谢重编程能够使肿瘤细胞满足其恶性进展所需的能量需求，其中糖代谢途径在肾癌发生发展中发挥着重要作用[6,7]。糖醛酸代谢途径作为糖酵解途径的分支之一，其关键酶主要在肝、肾中高表达，然而在肾癌中表达显著降低。因此糖醛酸途径可能在ccRCC发生发展中具有一定功能。已发现糖醛酸途径关键酶二羰基/L-木酮糖还原酶(dicarbonyl and L-xylulose reductase, DCXR)在乳腺癌、前列腺癌及肝细胞癌等肿瘤中发挥功能[8,9,10,11,12],我们前期通过TCGA数据库发现，在泛癌水平上肾癌中的DCXR表达水平下调最为显著，然而DCXR在肾癌发生发展中的功能尚不清楚。本研究通过TCGA数据库与临床样本验证了ccRCC中DCXR的表达情况，并通过本中心样本进一步分析了DCXR表达及其与肿瘤远处转移、分期和患者预后的关系。另外，我们同样在体外实验显示了DCXR在影响ccRCC细胞增殖迁移上的作用并通过GSEA分析初步预测了DCXR可能参与的分子学机制。现报告如下。

1、材料与方法

1.1 实验材料

收集2022年6月30日—2023年1月30日解放军总医院第一医学中心的30例ccRCC组织及配对的癌旁肾组织。患者术前均未进行过抗肿瘤治疗，知情同意书齐全。所有样本手术切除后于液氮中冻存15 min后-80 ℃长期保存。人肾癌细胞株786-O、ACHN、769-P及正常肾细胞株HK2、293T由本实验室保存。CCK-8试剂盒购自北京兰博利德商贸有限公司。Transwell小室及细胞培养耗材均购自美国corning公司。所涉及的序列引物均由北京天一辉远生物公司合成。所有载体质粒均由上海瑞捷生物工程有限公司合成。DMEM、1640、MEM培养液和胎牛血清(Fetal Bovine serum, FBS)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞转染相关试剂购自美国PolyPlus公司。qRT-PCR实验相关试剂购自南京诺唯赞生物科技公司。蛋白质印迹检测相关试剂购自武汉碧云天生物技术有限公司。DCXR抗体(15188-1-AP)购自proteintech, β-Tubulin抗体(BE3212-100)及山羊抗兔二抗均购自北京柏奥易杰科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

786-O、769-P细胞用含有10%FBS的1640培养液培养，ACHN细胞用含有10%FBS的MEM培养液培养，293T细胞用含有10%FBS的DMEM培养液培养，以上细胞均在37 ℃、5%二氧化碳浓度、湿度95%的培养箱中培养。细胞培养达到视野密度95%后，使用0.25%胰蛋白酶溶液进行细胞消化，800 r/min离心5 min, 使用相应培养液进行重悬传代，用对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 分组处理

在细胞密度约40%的293T细胞中进行慢病毒包装，将对照空载质粒空载对照及过表达DCXR质粒转入细胞内，经过48 h后将产毒培养液以4∶1比例加入病毒浓缩液过夜浓缩，将浓缩病毒液加入相应转染组细胞进行转染24 h, 使用嘌呤霉素(2 μg/mL)加入培养液培养5 d筛选出转染成功的细胞。使用实时定量逆转录聚合酶联反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法与蛋白质印迹检测细胞转染效率，确认过表达效率达到要求后用于后续实验。

1.2.3 qRT-PCR检测

收集需要检测的细胞及组织，提取总RNA,逆转录合成cDNA。用cDNA为模板，进行qRT-PCR实验检测DCXR的表达水平，应用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。实验重复3次。qRT-PCR反应(20 μL)35个循环。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4 蛋白质印迹检测(WB)

使用RIPA溶液、PMSF与0.1%蛋白磷酸酶抑制剂提取细胞及组织蛋白。各组蛋白(25 μg)经10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白。电泳、转膜后，5%脱脂牛奶封闭1 h, 加入DCXR(1∶1 000)抗体，4 ℃过夜。TBST洗膜后室温孵育二抗(1∶5 000)1 h, ECL显色，实验重复3次。

1.2.5 CCK-8检测

将各组细胞以2×103个/孔的密度铺于96孔板中，每组设置3个复孔，在细胞贴壁后以0、24、48、72和96 h时间点加入10 μL CCK-8试剂，避光孵育2 h后用酶标仪450 nm波长处测量每孔OD值。实验重复3次。

1.2.6 细胞克隆形成检测

将各组细胞以700个/孔接种于6孔板中，以相应的1640、MEM完全培养液培养10 d, 弃去培养液。用PBS轻柔冲洗2次，使用4%细胞组织固定液固定15 min, 使用PBS轻柔冲洗2次，使用0.1%结晶紫溶液染色30 min, 使用PBS轻柔冲去结晶紫。进行空气干燥。镜下观察细胞团大于50个细胞进行计数，实验重复3次。

1.2.7 细胞划痕实验

将各组细胞传代接种于6孔板中，待各组细胞密度均生长至95%左右，用200 μL枪头在细胞上轻柔划出“十”痕，用PBS溶液轻柔清洗漂浮细胞后，加入相应无血清培养液，在显微镜下拍照。无血清培养液培养24 h后观察细胞愈合情况，在显微镜下拍照，图像用image J软件进行处理，实验重复3次。

1.2.8 Transwell实验

将各组细胞使用相应无血清培养液进行重悬，细胞计数后加入2×104个细胞至transwell小室中，小室下24孔板中加入10%FBS完全培养液，培养12 h后将小室取出，使用PBS轻柔冲洗3次，使用4%细胞组织固定液固定15 min, 使用PBS轻柔冲洗2次，使用棉签轻轻擦去上层小室中的细胞，使用0.1%结晶紫溶液染色30 min, 使用PBS轻柔冲去结晶紫。进行空气干燥。显微镜下拍照，镜下观察细胞进行计数，实验重复3次。

1.2.9 免疫组织化学染色

本实验室已构建了包括144个ccRCC样本和106个相邻的正常组织样本(2015年1月—2017年12月)的组织微阵列，经解放军总医院机构审查委员会的批准，患者同意将其组织用于科学研究。所有ccRCC标本均由病理专家确认，并根据第8届美国癌症联合委员会TNM分期系统进行临床分期。将组织微芯片按照既往发表的方法进行免疫组织化学染色[13]。所有样品均与兔单克隆抗DCXR(15188-1-AP)抗体在4 ℃过夜。2位病理学家独立评估免疫组织化学切片，使用半定量评分系统评估染色强度(阴性=0,弱=1,中等=2,强=3)和染色细胞比例(0=0,≤25%=1,>25%～50%=2,>50%～75%=3,>75%=4)。每个样本的最终得分通过2组评分相乘，最低为0,最高12分。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0和Graphpad 9.0对数据进行统计学分析。计量资料采用Shapiro-Wilk(S-W)检验进行正态分布检验，符合正态分布以表示，2组间差异比较采用t检验，多组间采用单因素或多因素方差分析，两两多重比较采用SNK-q法，检验水准α=0.05(双尾)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 DCXR在肾癌组织与细胞中的表达情况

首先，我们通过TCGA数据库在泛癌中分析了DCXR的表达情况，发现在肾癌中DCXR表达水平显著下调(图1a)。通过qRT-PCR与蛋白质印迹检测，我们发现ccRCC组织中DCXR表达水平为(0.28±0.15),显著低于癌旁组织的(1.06±0.35),差异有统计学意义(P<0.001)(图1b、c)。另外，在肾癌细胞系中我们同样通过蛋白质印迹与qRT-PCR检测发现与293T细胞相比，786-O、769-P、ACHN细胞株中DCXR蛋白表达量较低(图1d、e)。基于上述实验结果，我们选择DCXR表达较低的786-O与ACHN细胞株用于后续的功能实验。

2.2 过表达DCXR对786-O、ACHN细胞增殖的影响

我们分别构建了过表达DCXR的肾癌细胞系786-O与ACHN,并通过qRT-PCR及蛋白印迹实验验证了过表达效率(图2a～c)。随后在上述细胞系中我们通过CCK-8实验发现在48、72及96 h, 786-O与ACHN细胞中对照组细胞(OE-NC)的增殖活力显著高于过表达DCXR组(OE-DCXR)(P<0.05)。克隆形成实验结果显示在786-O与ACHN细胞中，与对照组相比，过表达DCXR组细胞克隆形成率更低(图2d～f)。这些结果表明，DCXR能够抑制肾癌细胞的增殖能力。

2.3 过表达DCXR对786-O、ACHN细胞迁移的影响

进一步我们检测了DCXR对肾癌细胞迁移的影响。细胞划痕实验结果显示在786-O细胞中，过表达DCXR组(0.40±0.04)愈合面积较对照组(0.92±0.01)更小。在ACHN细胞中，同样观察到此结果，P值均<0.05。Transwell实验结果显示，在786-O与ACHN细胞中，过表达DCXR组较空载对照组的细胞数量更少，且P值均<0.05(图3a、b)。这些结果表明，DCXR可能能够抑制肾癌细胞的迁移能力。

图1 DCXR的表达情况   

图2 DCXR敲低细胞系验证及与肿瘤增殖的关系   

图3 DCXR与肿瘤迁移的关系   

2.4 GSEA分析ccRCC样本中DCXR参与的相关通路

在明确了DCXR在肾癌细胞恶性生物学行为中的作用后，我们通过TCGA数据库中ccRCC的转录组数据进行了GSEA富集分析，对DCXR可能参与信号通路及相关机制做了初步预测。我们发现相较于高表达组，低表达DCXR组显著富集于肿瘤相关通路及肾细胞癌通路，这进一步印证了本次实验结果。采用GSEA富集分析DCXR时，我们发现相关信号通路富集于JAK-STAT、TGF-β、WNT及MAPK信号通路，提示DCXR可能通过调控这些信号通路在肾癌恶性进展中发挥重要作用。同时，我们发现DCXR也富集于NK细胞介导的细胞毒作用及T、B细胞受体相关的信号通路，提示DCXR还可能通过影响肾癌免疫在肿瘤进展中发挥功能。另外，作为一种代谢相关分子，DCXR也富集于谷胱甘肽及酪氨酸代谢过程。结合本次GSEA富集分析，我们下一步将对上述预测的主要相关通路进行研究(图4)。

图4 GSEA富集分析DCXR可能参与调节肾细胞癌的相关信号通路  

2.5 DCXR表达量与ccRCC临床相关性及预后

进一步我们采用组织芯片染色评估了DCXR表达水平与ccRCC患者预后之间的关系，发现肿瘤组织中DCXR染色程度较浅，且染色定位于细胞质，表明DCXR在肾癌中的蛋白表达明显低于癌旁，这与WB的结果相一致(图1c)。在对染色情况打分后，我们根据组织染色的中位评分6分将患者分为DCXR低表达组与DCXR高表达组(图5a)。Kaplan-Meier分析显示，DCXR低表达组患者的总生存期较DCXR高表达组患者差(P<0.05,图5b)。另外，通过多因素Cox回归分析发现，DCXR表达水平、是否淋巴结转移及肿瘤分期是影响ccRCC患者生存的独立危险因素，其中高表达DCXR是肾癌患者的保护性因素(图5c),最后我们通过TCGA数据库验证发现高表达DCXR组患者预后优于低表达DCXR组患者(图5d)。

图5 DCXR的临床相关性分析   

3、讨论

肾细胞癌占肾脏肿瘤病理亚型的90%,由于目前治疗手段单一，因此具有巨大的治疗前景。近年针对ccRCC的研究和治疗进展迅速，但治疗效果仍不理想，迫切需要找到合适有效的靶点药物完善治疗方案[2]。

目前研究已明确多种肿瘤的发生发展与代谢改变显著相关[3]。其中糖代谢途径在肾癌进展中发挥着重要作用[5]。糖代谢有多个分支，包括糖酵解途径、糖异生途径、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径和多元醇途径[14]。目前研究证实，糖异生途径可增加糖酵解途径的中间产物以促进肿瘤细胞增殖[15],而磷酸戊糖途径上调能够提供核糖前体和NADPH以抑制氧化应激[16],另外多元醇途径也发现与癌症侵袭性相关[17]。糖醛酸途径相关基因在肾脏中表达较高，然而糖醛酸途径相关基因在肾癌发生发展中的功能却少有报道。

糖醛酸代谢途径作为糖酵解途径的分支之一，主要在肝脏中进行。糖醛酸已发现在肝脏中能与多种有害物质结合具有解毒作用，还能参与己糖胺途径生成糖胺聚糖，最后生成的木酮糖-5-磷酸进入磷酸戊糖途径，在糖代谢途径中发挥重要作用[18]。代谢异常可能为ccRCC提供治疗干预的新靶点。DCXR作为糖醛酸途径关键酶之一，在哺乳动物中序列高度保守，酶活性为催化L-木酮糖转化为木糖醇，在近端肾小管中的发挥细胞渗透调节的作用[19]。作为催化酶，DCXR缺失会使L-木酮糖在血液中堆积导致戊糖尿[20]。在其他非癌疾病中，DCXR与男性不育症及肾病相关[8],能够影响精子-透明带相互作用[12]。在肿瘤相关研究中发现，DCXR在多种肿瘤组织中异常表达，例如在黑色素瘤中DCXR过表达且可促进细胞黏附进展和肿瘤转移[21],在前列腺癌与乳腺癌中DCXR表达同样上调，并通过有氧糖酵解方式促进肿瘤增殖及细胞周期进展[9,11],另外研究发现在肝细胞癌中，高表达的DCXR是术后患者预后的独立生物学标记物。

本研究基于TCGA数据库分析了泛癌中糖醛酸代谢通路关键基因DCXR表达情况，并着重检测了肾细胞癌中DCXR的表达情况。我们发现相对于癌旁组织，肿瘤组织中的DCXR表达水平显著下调。进一步发现DCXR参与调节肾癌细胞增殖、迁移等多种恶性生物学行为。随后，我们继续通过TCGA数据库进行了GSEA分析，发现DCXR可能通过JAK-STAT、TGF-β、WNT及MAPK信号通路影响肿瘤发展。已有研究发现DCXR与E-cadherin共定位并可影响肿瘤细胞EMT及细胞黏附[22],同时在EMT及细胞黏附中TGF-β信号通路发挥着重要作用，因此结合GSEA分析DCXR也可能通过TGF-β信号通路影响肿瘤细胞EMT及细胞黏附[21]。最后，我们结合本院临床数据分析了DCXR与ccRCC患者临床病理因素的相关性，发现DCXR表达水平与患者不良预后显著相关。因此目前的研究结果表明，DCXR在肾癌中可能发挥抑癌基因作用，并与肿瘤进展有关。该实验结果为DCXR作为ccRCC潜在的临床诊断或预后标志物奠定了分子学基础。

基金资助:国家自然科学基金(No:81802804);中国人民解放军总医院国家优秀青年科学基金培养基金(No:2020-YQPY-006);解放军总医院青年自主创新科学基金成长项目(No:22QNCZ029);

文章来源:欧阳清,郑斌,巫胜攀,等.二羰基/L-木酮糖还原酶在肾细胞癌发生发展中的功能及潜在机制[J].临床泌尿外科杂志,2024,39(04):314-320.