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SLC25A21在肾透明细胞癌发病机制中的作用

2024-06-26 29 上传者：管理员

摘要：目的探讨SLC25A21在肾透明细胞癌细胞(786-0)中的作用。方法利用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)、免疫荧光及Western印迹分析786-0中SLC25A21表达差异。慢病毒感染786-0构建SLC25A21过表达人肾透明细胞癌细胞系SLC25A21-OE,通过Transwell实验和划痕实验确定SLC25A21对786-0细胞转移能力的影响，通过细胞克隆形成能力实验，如细胞集落形成实验等检测SLC25A21-OE对786-0克隆形成能力的影响。结果 SLC25A21在肾透明细胞癌组织中的表达较正常组织明显上调，肾透明细胞癌患者SLC25A21表达明显上升，且与预后呈明显负相关(P<0.05)。结论 SLC25A21上调在促进人肾透明细胞癌的发展中起关键作用。SLC25A21在786-0中表达上调，尤其与786-0的侵袭性和不良预后呈负相关。

关键词：
泌尿外科
线粒体溶质载体家族(SLC)25A21
细胞786-0
肾癌
肾透明细胞癌
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肾癌是泌尿外科最常见的肿瘤疾病，肾癌的病理类型包括肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色性肾细胞癌、集合管癌、肾髓质癌等，其中最常见的是肾透明细胞癌。中晚期肾透明细胞癌无法手术彻底切除，其对放射治疗、化学治疗又不敏感，免疫治疗仅起到一部分作用，其一直是困扰泌尿外科医生的一个问题。自从近年来靶向药物的问世，对于晚期肾癌的治疗，起到了一定的疗效，曾经给临床医生及患者带来欣喜，但是效果仍然不十分理想[1],延长患者的生存期有限，所以寻找一个更有效的靶向治疗药物，抑制肿瘤生长，是迫切需要解决的问题，也是广大肾癌患者的希望[2]。临床医生及科研人员也在积极努力在寻找一个更好的控制肿瘤生长的途径。线粒体溶质载体家族(SLC)25蛋白是进入或离开细胞的主要调节因子之一，其转运作用与细胞的生理过程有一定联系，如SLC6和SLC18家族的特异性转运蛋白，它们会调节神经递质在突触中的浓度[3]。许多不同的SLC家族也参与运输营养物质，通过组织间的选择性屏障，为其提供必需的营养物质[4]。

根据转运底物的不同，转运代谢产物的方式依赖于线粒体的膜电势和pH值，不同线粒体载体(MC)的运输方式有所不同。根据底物的不同性质，MC大致可分为以下几类：二核苷酸的载体、核苷酸和氨基酸、羧酸、酮酸的载体及一些附加底物[5,6]。SLC25A21载体作为SLC25的一员，在线粒体内膜中发挥作用，其主要职能是负责在线粒体内三羧酸循环(TCA)过程中，将产生的中间代谢产物α-铜戊二酸(KG)转运至胞质中，在此过程中胞质中的氧乙二酸也转运至线粒体内，SLC25A21载体除了转运α-KG外，还具有转运少量草酰乙酸、柠檬酸、戊二酸、己二酸等的能力[7]。转运载体SLC25A21在维持线粒体α-KG水平时发挥了重要的分子屏障作用，通过改变胞质中α-KG与线粒体之间的流动，可能影响其异常表达，继而影响了谷氨酰胺(Gln)代谢，从而调控肿瘤细胞生长[8]。目前关于SLC25A21在相关肿瘤的临床研究及分子调控机制未见详细报道，在肾透明细胞癌中的相关研究更是未见报道。本研究探讨SLC25A21在肾透明细胞癌发病机制中的作用。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

人肾透明细胞癌细胞(786-0)与人肾正常细胞(HEK-293)购于海星公司；SLC25A21过表达慢病毒购自安震生物公司；活性氧(ROS)、线粒体膜电位(JC)-1试剂盒购自中国碧云天生物公司；SLC25A21抗体购自爱博泰克公司；Western印迹二抗(山羊抗兔)、Western二抗(山羊抗鼠)均购自美国Proteintech公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国Millipore公司；双抗(青霉素、链霉素)购自美国HyClone公司；RPMI1640基础培养液购自生航生物。

1.2慢病毒感染细胞构建SLC25A21过表达细胞系及分组

取对数生长期的细胞接种于96孔板中，接种浓度约为5×104个细胞/孔，细胞用10%(V/V) FBS RPMI1640培养液混匀，铺板时细胞融合率为50%左右，每孔加入2 ml培养液(不含双抗),当细胞的融合率为70%左右，加入稀释好的病毒(稀释比为1∶10 000),置于37℃恒温、5%CO2孵箱内培养72 h。添加G418筛选剂：弃去培养皿中培养基，使用PBS清洗细胞1遍后，在6孔板内各孔注入含600 nmol/L G418的筛选培养基培养目标细胞。观察细胞生存状况及培养基颜色变化，每3～5 d换1次筛选培养基。细胞大量死亡时，降低G418至300 nmol/L进行持续筛选。SLC25A21-OE来源于安震生物公司，其引物序列(5′-3′):SLC25A21-OE(人)正向：CAGAGATGTGCAACCGATCCA,反向：GGGGTTTCAGCCAAGATAGGT。依据慢病毒使用说明，构建稳定过表达SLC25A21蛋白的786-0细胞系为SLC25A21-OE组，未经过表达处理的细胞为对照组。

1.3 Western印迹测定蛋白表达

按既定分组分别处理细胞后，收集细胞，加入细胞裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5,150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L钠-乙二胺四乙酸(EDTA),1 mmol/L EDTA,1%(V/V) Triton X-100,2.5 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/Lβ-甘油磷酸钠，1 mmol/L Na3VO4,1 mmol/L NaF,1μg/ml亮抑酶肽和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]提取全细胞蛋白，利用Biorad试剂测定蛋白浓度，计算蛋白质上样体积，利用10%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量的蛋白质(电泳条件：浓缩胶80 V,30 min;分离胶120 V,1 h),将蛋白转到PVDF膜上(转膜条件：30 W,40 min),用5%(W/V)的脱脂奶粉室温封闭1.5～2.0 h,加入相应一抗4℃ 过夜，二抗室温孵育1.5～2.0 h后，用凝胶成像仪获取蛋白质成像图，应用Quantity One软件对蛋白质表达水平进行量化分析。

1.4实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测mRNA表达量

将提取到的RNA逆转录为cDNA,根据实验所需设计引物，购买自生工公司。将反应总体系加入八连管，总体积为20μl;放入RT-qPCR仪器中，使用设置好的程序，应用RT-qPCR三步法扩增目的基因；计算目的基因mRNA的表达量。

1.5免疫荧光检测蛋白表达量

取对数生长的786-0接种于24孔板中，接种浓度约为6×104个/孔，依据不同组(MOCK、SLC25A21-OE),移去培养液，用4%(W/V)多聚甲醛固定20 min,用0.1%(V/V)的四丁酚醛(Triton)X-100孵育5 min,使细胞膜通透性增加，牛血清白蛋白(BSA)封闭后用相应的一抗[活化的胱天蛋白酶(caspase)-3、葡萄糖调节蛋白(GRP)78和C/EBP同源蛋白(CHOP)]4℃孵育过夜，二抗室温避光孵育30 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，Hoechst33342室温避光孵育5 min, PBS冲洗后封片剂封片，依据荧光分布与强度在激光扫描共聚焦显微镜下检测细胞内目的蛋白定位及表达水平。

1.6细胞集落实验检测细胞增殖能力

取对数生长的786-0与过表SLC25A21的786-0接种于6孔板中，接种浓度约为1 000个细胞/孔；置于孵箱中培养7～10 d,当出现肉眼可见的细胞克隆时，停止培养；弃去培养液，PBS清洗，甲醇固定30 min,弃液，干燥；每孔加1 ml结晶紫染色15 min,用缓慢水流洗去染色液，干燥后于显微镜下观察计数。

1.7细胞划痕实验检测细胞2D水平面迁移能力

先用马克笔在6孔板的后面间隔0.5～1.0 cm均匀的画横线，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；在6孔板中每孔铺入7×104个细胞后置于37℃细胞孵箱孵育24 h;用1 ml枪头比着直尺，垂直于6孔板后面的横线划痕；用PBS清洗细胞3次，洗去划落的细胞，加入无血清培养液继续培养；按0、24 h取样，倒置显微镜观察特定位置细胞情况并拍照。

1.8 Transwell实验检测细胞3D立体迁移能力

细胞接种前1 d使用无血清培养液饥饿培养24 h;弃去培养液，将细胞消化收集并计数；将细胞小室中的液体吸掉，24孔板下室加入500μl含10%FBS的培养液；上室加入200μl无血清培养细胞悬液，静置15 min ;将24孔板轻轻放入细胞孵箱培养48 h ;取出Transwell小室，吸走培养液，PBS清洗两遍；在24孔板干净的孔中加入4%多聚甲醛，小室底面浸入溶液中固定10～15 min ;弃去液体，PBS洗两遍，将小室底面浸入0.1%结晶紫染色5～10 min;纯净水清洗小室，用棉签轻轻擦拭小室的上室，显微镜下观察并拍照。

1.9统计学分析

采用SPSS20.0、GraphPad7.0软件进行单因素方差分析。

2、结果

2.1 SLC25A21在786-0及HEK-293中的表达

与786-0中SLC25A21蛋白表达(1.53±0.11)比较，HEK-293(1.04±0.06)明显更低(t=6.773,P=0.000 2),见图1。

2.2构建稳定过表达SLC25A21细胞系

经过含过表达病毒的转染处理后，与对照组(未处理的对照细胞群体)SLC25A21蛋白及mRNA表达(0.80±0.04、46.48±0.73)比较，SLC25A21-OE组SLC25A21 mRNA及蛋白表达(0.85±0.07、101.22±0.91)显著提升(t=38.22、66.14;P=0.007 0、0.000 1),见图2、图3。

图1 786-0与HEK-293中SLC25A21蛋白表达

图2两组SLC25A21蛋白表达

图3两组SLC25A21表达(免疫荧光，×100)

2.3过表达SLC25A21对786-0体外迁移能力的影响

Transwell小室实验结果表明，在过表达SLC25A21的情况下，786-0通过多孔聚碳酸酯膜的数量[(1 184±24.72)个]较对照组[(777±74.31)个]显著提升(t=7.452,P=0.001 7),提示SLC25A21高表达可能促进786-0的转移能力，见图4。划痕实验结果显示，与对照组[(12.93±0.39)%]相比，过表达后，SLC25A21-OE组786-0迁移能力[(73.14±0.49)%]显著上升(t=87.20,P=0.000 1),见图5。

2.4过表达SLC25A21对786-0克隆形成能力的影响

细胞集落形成实验结果显示，与对照组[(255±6.24)个]相比，SLC25A21基因的增强表达显著提高了786-0的克隆生成数[(397±13.10)个；t=17.09,P=0.003 4],证明上调SLC25A21基因表达有利于增强786-0的克隆形成能力，见图6。

图4过表达SLC25A21对786-0迁移能力的影响(结晶紫染色，×40)

图5过表达SLC25A21对786-0迁移能力的影响(×40)

图6过表达SLC25A21对786-0克隆形成能力的影响(结晶紫染色) 下载原图

3、讨论

本研究阐明SLC25A21上调在促进人类肾透明细胞癌发生和发展中起着关键作用。通过体外功能获得实验，证实SLC25A21是肾透明细胞癌中一个重要的肿瘤促进基因。SLC25是一个核编码转运蛋白大家族，嵌入线粒体内膜中，少数情况下嵌入其他细胞器膜中。这个超家族的成员广泛存在于真核生物中，参与多种代谢途径和细胞功能。近年来，SLC25基因的突变被证明与一些疾病有关，突出了SLC25在生理和病理意义上的重要作用。

自从发现了肾透明细胞癌后，才意识到这是一种严重危害健康的疾病，而且随着人们对疾病的不断探索，发现肿瘤的发生和发展是一个非常复杂的过程。一些研究认为，癌细胞代谢异常与肿瘤的发生和发展之间存在着很大的关系[9]。肿瘤的发生与发展是原癌基因的激活和或抑癌基因的灭活，代谢紊乱只是肿瘤发展过程中的伴生事件，但随着研究的深入，逐渐发现代谢紊乱并非只是相关现象，而是肿瘤进展过程中不可逆的中心环节[10]。研究显示，葡萄糖缺乏可引起野生型Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)通道基因突变[8],显示代谢异常可引起原癌基因突变。说明代谢紊乱在肿瘤发生与进展过程中扮演着重要角色。代谢性肿瘤的发生和发展，被越来越多的研究认为是互为关联的。肿瘤早期诊断和疾病预后越来越多地使用一些代谢相关的中间代谢产物，使这些代谢相关的指标为肿瘤的治疗提供了新的目标和方向。

在人类当中，SLCA25A21普遍表达，组织间差异很小。SLC25A21载体蛋白，主要负责将胞质中的氧代己酸转运至线粒体，再将TCA中α-KG转运至胞质中。一些与肿瘤相关的SLC25A21基因研究并不常见，仅在鼻咽癌患者中发现了异常[8,9]。据相关文献报道，利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析发现，大肠癌、子宫内膜癌、胃癌、食管癌、头颈膀胱癌等肿瘤与相应的正常组织相比，其SLC25A21表达水平较低；但在胰腺导管腺癌、肝细胞癌、宫颈癌乳腺癌中，其表达水平与正常组织相比无明显差异，但总体呈递减趋势。SLC25A21仅在前列腺癌、肺腺癌、肺鳞癌中表达升高[11],表明其在肿瘤组织中的表达下降是显著特征，其异常表达很可能是肿瘤发生和发展的关键调控点[12]。

然而，这些疾病的影响和机制尚未确定。本研究发现，SLC25A21在肾透明细胞癌组织中的表达与正常肾组织相比显著上调，SCL25A21的高表达与肾透明细胞癌患者的侵袭性和低生存率显著相关。表明SLCA25A21表达下调可以作为预测肾透明细胞癌进展的较高风险的指标。

本文结果表明，SLC25A21在肾透明细胞癌细胞中比正常肾组织细胞有明显的上调；SLC25A21在肾透明细胞癌患者中的表达上升和预后不良之间呈负相关，表明SLC25A21在肾透明细胞癌中过表达后，促进细胞生长，反之将其沉默就可发挥肿瘤抑制作用。本研究表明，SLC25A21是肾透明细胞癌进展的潜在预测因子和治疗靶点。

SLC25A21过表达能在肾透明细胞癌细胞的运动、克隆形成、增殖和迁移中特异性地发挥重要作用。然而，SLC25A21介导肾透明细胞癌进展的机制尚不清楚。人SLC25A21的主要生理功能可能是催化2-氧己二酸摄取到线粒体和α-KG从线粒体流出到胞质。α-KG是TCA的中间产物，在细胞代谢和生理中发挥重要作用。作为一种生物物质，α-KG对脂肪酸、氨基酸和葡萄糖的氧化是必不可少的，并且是合成谷氨酸和Gln的碳骨架。此外，已经证实α-KG可以作为一种真正的抗氧化剂，因为其直接与过氧化氢反应生成琥珀酸、水和CO2。补充α-KG可直接或间接刺激内源性抗氧化防御，但其确切作用机制及其功能仍需进一步明确。

综上，SLC25A21上调在促进人肾透明细胞癌的发育中起着关键作用。SLC25A21在肾透明细胞癌组织中表达上调，尤其与肾透明细胞癌患者的侵袭性和不良预后呈负相关。

参考文献:

[11]胡莎莎.SLC25A21通过调控肿瘤代谢重编程抑制KRAS突变型结直肠癌演进的分子机制[D].广州:南方医科大学,2019.

基金资助:吉林省科学技术厅自然科学基金项目(212558JC010486547);

文章来源:顾有为,李雅舒,沈璐妍,等.SLC25A21在肾透明细胞癌发病机制中的作用[J].中国老年学杂志,2024,44(12):2970-2974.