骨重建是一个骨形成和骨吸收动态平衡的过程，当骨吸收大于骨形成时出现骨质疏松等疾病[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stromal cells, BMSCs)具有强大的骨形成能力，是骨组织工程中最常用的干细胞之一，近年来备受关注。明确骨组织矿化过程中的分子生物学机制，对于推动骨组织工程的研究具有重要意义。

黑色素瘤相关抗原D1(melanoma associated antigen D1,Mage-D1),又称Dlxin-1或NRAGE,是由Pold等首次克隆并鉴定为Ⅱ型黑色素瘤相关抗原基因家族的新成员，它位于X性染色体上，由13个外显子构成，全长6 601 bp。编码的蛋白由3个结构域构成，分别是MHD2、MHD和连接两者的IRD[2]。Mage-D1的功能广泛，可与多种核蛋白、细胞表面受体和转录因子发生相互作用，参与细胞分化、迁移、增殖、周期、凋亡和转录调控等[3-7]。近年来，有关Mage-D1对硬组织(包括骨骼和牙齿)发育与矿化影响的研究逐渐增多。敲除Mage-D1后，小鼠体内破骨细胞数量和表面积均有增加。同时，敲除Mage-D1可增强RANKL/OPG比值，促进成骨细胞介导的破骨细胞分化[8]。此外，敲除Mage-D1可诱导自噬相关基因的表达，并通过增加破骨细胞的活性和分化来加速牙周炎的进程[9]。研究表明Mage-D1可通过调控NF-κB信号通路，参与成牙本质细胞的分化[10]。

尽管多项研究表明Mage-D1参与矿化相关活动，但是关于Mage-D1调控骨代谢活动的直接证据仍然缺乏。因此，本研究旨在通过体内和体外实验阐明Mage-D1基因敲除对小鼠股骨骨量以及大鼠骨髓间充质干细胞矿化能力的影响。这将为支持Mage-D1具有正向调控矿化能力的观点提供更全面的理论支持和更充分的实验依据，也为其在骨组织工程中的发展前景提供一定的参考。

1、材料与方法

1.1 实验动物

自赛业生物科技有限公司购买6～8周龄、背景为C57BL/6的雌性Mage-D1基因敲除杂合子小鼠和雄性野生型(wide type, WT)小鼠，作为亲本小鼠繁育Mage-D1基因敲除纯合子(Mage-D1 knock out, Mage-D1 KO)小鼠，饲养于西南医科大学实验动物中心无特定病原体(SPF)级动物房。3周龄SD大鼠购买自西南医科大学实验动物中心。本实验获得西南医科大学动物伦理委员会批准(201903-187)。

1.2 主要试剂

α-MEM培养基(普诺赛，中国),胎牛血清(Gibco, 美国),鬼笔环肽、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天，中国),大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒、茜素红染色液 (OriCell, 中国),地塞米松、β甘油磷酸钠五水合物、维生素C(Solarbio, 中国),CCK-8试剂盒(Apexbio, 美国),CD29、CD34、CD44、CD45、CD90抗体、ALP抗体、鼠二抗(Santa Crus, 美国),Mage-D1抗体(Antibodies, 英国),β-actin抗体(华安，中国),Runx2抗体(Abcam, 美国),Col1抗体(Proteintech, 中国),山羊抗鼠IgG-FITC(Bioworld, 美国)、山羊抗兔IgG-FITC(Bioworld, 美国),山羊抗兔二抗(Affinity, 美国),细胞周期试剂盒、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(赛默飞，美国),TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(TaKaRa, 日本),沉默慢病毒(吉凯基因，中国),钙含量检测试剂盒、血清磷含量检测试剂盒、小鼠降钙素试剂盒、小鼠甲状旁腺素试剂盒(睿信，中国)。

1.3 方法

1.3.1 Mage-D1敲除小鼠的鉴定

剪取10～15日龄小鼠鼠尾，提取鼠尾DNA后进行PCR扩增，PCR反应体系包括DNA、正引物、反引物、2×Taq预混液和ddH2O,取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并使用凝胶成像系统显影、采集图像。提取15日龄同窝雄性Mage-D1 KO小鼠和野生型小鼠股骨RNA,实时荧光定量PCR检测股骨Mage-D1基因表达量。引物序列参见表1。

表1 小鼠引物序列

1.3.2 Mage-D1敲除小鼠血清指标检测

内眦取血法提取10月龄同窝雄性Mage-D1 KO小鼠和野生型小鼠血液，4 ℃过夜，离心取上清，根据钙离子、磷离子、降钙素、甲状旁腺素的检测试剂盒实验方法操作，酶标仪检测660 nm处光密度值，根据公式计算小鼠血清中相应指标的含量。

表2 大鼠引物序列

基因引物序列(5′–3′)

1.3.3 Mage-D1敲除小鼠股骨CT扫描

过量二氧化碳处死10月龄同窝雄性Mage-D1 KO小鼠和野生型小鼠后分离股骨，4%多聚甲醛固定后，应用Micro-CT对小鼠股骨进行扫描重建，用Hiscan Analyzer software选择感兴趣区域(ROI)进行数据分析。ROI:股骨远端生长板下4 mm开始，长2 mm的皮质骨；股骨远端生长板下1.5 mm开始，长2 mm的松质骨。

1.3.4 提取BMSCs细胞

过量CO2处死3周龄SD大鼠后在无菌状态下取出股骨和胫骨，剔除软组织。剪去股骨和胫骨的两端后，用完全培养基冲洗骨髓腔至骨头发白，收集骨髓液，离心后加入含10%血清的培养基，接种至培养皿中，放置于细胞培养箱中进行培养。

1.3.5 流式检测BMSCs细胞表面抗原表达

生长情况良好的P3细胞消化离心后，加入4%多聚甲醛4 ℃固定30 min, PBS清洗后弃上清，加入含3%FBS的PBS混匀，细胞计数后置成5×105个/mL的混悬液。分组后分别加入CD29、CD34、CD44、CD45、CD90抗体4 ℃过夜。加入对应种属荧光二抗避光孵育2 h, 离心后PBS稍洗，加入含3%FBS的PBS重悬后用流式细胞仪检测BMSCs细胞表面抗原的表达。

1.3.6 细胞成脂诱导

将BMSCs置于6孔板中培养，待细胞密度至85%左右时，培养基换为成脂诱导培养基，当诱导至镜下可看到脂滴时，弃除培养基，4%多聚甲醛固定30 min, 加入油红O染液染色30 min, PBS洗涤后进行采集图像。

1.3.7 碱性磷酸酶染色及茜素红染色

BMSCs接种至6孔板，待细胞密度为85%左右时，更换为矿化诱导培养基(含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 μg/mL维生素C,10% FBS,1%双抗的α-MEM培养基),每3 d换液，分别在7 d及21 d时弃除培养基用4%多聚甲醛固定细胞后，用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒及茜素红染液染色，观察、采集图像。

1.3.8 鬼笔环肽染色BMSCs细胞骨架

按照2×104个/cm2的密度将细胞铺于提前放好细胞爬片的6孔板中，并设置2个复孔。当细胞密度达到50%时，弃培养基，用PBS轻柔冲洗后加入细胞固定液处理15 min, 用配置好的0.5%的Triton破膜液处理5 min, 加入鬼笔环肽工作液避光孵育30 min, PBS清洗后加入含DAPI的封片液进行封片，使用显微镜进行图像的观察图采集。

1.3.9 细胞免疫荧光

将细胞铺于提前放好细胞爬片的6孔板中，待细胞密度至60%时，弃培养基，4%多聚甲醛固定15 min, 用0.5%的Triton破膜液处理10 min, 加入封闭液封闭30 min, 吸干封闭液后滴加Mage-D1抗体(1∶500),4 ℃过夜。次日常温复温1 h, 加入二抗山羊抗兔IgG-FITC(1:500)避光孵育1 h, PBS稍洗后加入含DAPI的封片液进行封片，采用荧光显微镜进行图像的采集。

1.3.10 Mage-D1沉默慢病毒的转染

根据Mage-D1的NCBI号(Gene ID:84469)委托上海吉凯基因科技有限公司构建Mage-D1沉默慢病毒。通过预实验确定最佳MOI为50,加入HiTransG P感染增强液提高感染效率，嘌呤霉素最佳浓度2 μg/mL。将慢病毒包被空载病毒和Mage-D1沉默病毒转染至BMSCs细胞中，加入病毒约48 h后按照最佳嘌呤霉素浓度筛选2 d, 去除转染失败的细胞。

1.3.11 RT-qPCR实验

分离小鼠股骨，将骨组织剪碎，加入液氮研磨至粉末状，加入Trizol, 静置后离心，吸取上清，加入氯仿，混匀静置后离心吸取水相，加入异丙醇，混匀静置后，离心去上清，酒精洗涤RNA,干燥后重悬，获得小鼠股骨RNA;去除细胞原培养基，PBS洗涤后加入Trizol, 后续同上。测量RNA的浓度后进行逆转录实验，用逆转录所得的cDNA进行定量PCR实验，反应体系包括cDNA、正反引物、无酶水、SYBR Premix。反应后用CT值和2-△△CT的方法进行计算。引物序列见表1、2。

1.3.12 Western blot实验

提取细胞总蛋白，BCA检测蛋白浓度后进行蛋白变性处理。根据蛋白浓度，每个泳道加入50 μg的蛋白，60 V电泳30 min后120 V电泳90 min。电泳停止后进行湿转，300 mA转1 h, 快速封闭液封闭30 min, 一抗(Mage-D1 1∶1 000,ALP 1∶100,Runx2 1∶500,Col1 1∶5 000,β-actin 1∶10 000)孵育并4 ℃过夜。次日孵育二抗，通过化学发光系统显影、采集图像。

1.3.13 细胞周期检测

将细胞铺于6孔板中，待细胞密度至85%时，消化洗涤细胞，加入预冷70%乙醇，4 ℃过夜固定，PBS清洗细胞2次后弃上清，加入细胞周期工作液，使细胞密度为1×106个/mL,室温避光孵育30 min, 上机检测。

1.3.14 CCK8检测细胞增殖

将细胞铺至96孔板中并设置副孔，次日，按照CCK-8:完全培养基为1∶100的比例配制检测液，并加入96孔板中，37 ℃避光孵育2 h后在450 nm处测得光密度，连续检测7 d后制作生长曲线图。

1.3.15 细胞迁移

将细胞铺于6孔板中，待细胞长满后，用枪头在底部划直线，使用无血清无双抗的培养基培养细胞，在划线后的0、12、24 h用倒置显微镜采集图像，使用Image J分析0、12、24 h划痕面积，细胞移动的面积与初始划痕面积之比为迁移率，即迁移率=(0 h划痕面积-12 h/24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。

1.4 统计学分析

实验数据用IBM SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料采用

进行统计描述。服从正态且方差齐的两组计量资料比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Mage-D1基因敲除小鼠的鉴定

为了鉴定子代小鼠基因型，提取10～15日龄小鼠鼠尾DNA,PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。鉴定结果显示：只有1条437 bp扩增条带的为Mage-D1基因敲除纯合子小鼠，只有1条417 bp扩增条带的为野生型小鼠，同时有1条417 bp扩增条带和1条437 bp扩增条带的为Mage-D1基因敲除杂合子小鼠(图1A)。提取15日龄同窝雄性Mage-D1敲除鼠和野生型小鼠的股骨RNA进行RT-qPCR检测，结果显示Mage-D1基因敲除小鼠股骨中Mage-D1表达显著降低(P<0.01,图1B)。

2.2 Mage-D1敲除小鼠股骨的Micro-CT检测

解剖10月龄Mage-D1敲除鼠和同窝野生型小鼠股骨，目视观察下发现不同窝小鼠股骨大小略有差异，但同窝Mage-D1敲除小鼠和野生型小鼠的股骨大小相近(图2A)。通过Micro-CT扫描小鼠整段股骨，并进行三维重建后发现Mage-D1敲除小鼠的骨小梁数较同窝野生型小鼠少，骨皮质厚度也较同窝野生型小鼠薄(图2B)。对ROI进行分析后发现，与野生型小鼠相比，Mage-D1敲除鼠股骨的皮质骨厚度减小、皮质骨矿物含量降低，松质骨矿物含量降低，松质骨骨表面密度降低，骨小梁数减少，骨小梁分离度增大(P<0.05,图2C)。

图1Mage-D1敲除小鼠的基因型鉴定及敲除效率验证

图2 10月龄Mage-D1敲除小鼠及同窝野生型小鼠股骨Micro-CT扫描检测

2.3 Mage-D1敲除小鼠的血清指标检测

通过化学法和ELISA对10月龄同窝雄性Mage-D1敲除小鼠和野生型小鼠的内眦血进行血清学指标检测，结果显示Mage-D1敲除小鼠的血钙、血磷、降钙素和甲状旁腺素均与同窝野生型小鼠组无明显差异(图3)。

2.4 大鼠BMSCs的培养及鉴定

本实验通过全骨髓培养法培养大鼠骨髓间充质干细胞，光学显微镜下可见细胞呈梭形，纤维样，排列成网状、旋涡状(图4A)。鬼笔环肽染色细胞骨架进一步表明细胞呈长梭形，具有成纤维细胞样形态(图4B)。流式细胞术检测BMSCs细胞表面抗原显示：BMSCs高表达干细胞表面标志物 CD29(97.67%)、CD44(97.65%)、CD90(99.01%),低表达造血干细胞表面标志物CD34(3.03%)、CD45(0.01%)(图4C)。成脂诱导BMSCs 14 d后油红O染色可在光学显微镜下观察到脂滴(图4D),矿化诱导BMSCs 21d后茜素红染色可在光学显微镜下观察到钙结节生成(图4E)。

图3 10月龄Mage-D1敲除小鼠及同窝野生型小鼠血清指标检测

2.5 Mage-D1在BMSCs内的表达

细胞免疫荧光检测BMSCs内Mage-D1的表达。可在荧光显微镜下观察到Mage-D1表达于整个细胞内，在细胞核及胞核周围区域高表达(图5)。

2.6 BMSCs内Mage-D1沉默效率

BMSCs转染慢病毒后，使用嘌呤霉素筛选2 d以去除未转染细胞，提取RNA和蛋白，并通过RT-qPCR及Western blot检测转染效率。将sh-NC组作为对照组，sh-Mage-D1组作为实验组，结果显示，Mage-D1的基因(P<0.01,图6A)和蛋白(P<0.01,图6B、C)表达明显下降。

2.7 Mage-D1对BMSCs细胞增殖、周期和迁移的影响

采用CCK-8法分别在0～7 d时检测sh-NC组和sh-Mage-D1组的光密度值，以光密度值的变化反映细胞增殖情况：从第1天起，sh-Mage-D1组细胞的增殖能力较sh-NC组明显降低(P<0.01,图7A)。流式细胞术检测sh-NC组和sh-Mage-D1组细胞周期，沉默Mage-D1后，细胞的G1期增加、S期降低、G2期增加(P<0.01,图7B)。采用划痕实验分别在12、24 h时检测sh-NC组和sh-Mage-D1组细胞的迁移能力，实验结果显示在12 h和24 h时，sh-Mage-D1组细胞迁移速度均明显快于sh-NC组(P<0.01,图7C、D)。

2.8 Mage-D1对BMSCs矿化能力的影响

矿化诱导7 d后提取sh-NC组和sh-Mage-D1组细胞的RNA和蛋白，分别进行RT-qPCR和Western blot检测。结果显示与sh-NC组相比，sh-Mage-D1组中矿化相关因子ALP、Runx2和Col1基因的表达均明显降低(P<0.05,图8A),蛋白表达也显著降低(P<0.01,图8B、C)。此外，矿化诱导7d后进行碱性磷酸酶染色(图8D),染色结果显示，与sh-NC组相比，sh-Mage-D1组碱性磷酸活性降低。在矿化诱导21d后进行茜素红染色(图8E),结果显示sh-Mage-D1组钙结节较sh-NC组减少。

2.9 Mage-D1调控矿化的潜在机制

细胞膜跨膜受体p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)和转录因子Dlx/Msx对牙齿及骨组织的生物矿化至关重要。沉默Mage-D1后，提取sh-NC组和sh-Mage-D1组细胞的RNA,进行RT-qPCR检测。结果显示与sh-NC组相比，sh-Mage-D1组中p75NTR和Msx1表达均降低(P<0.05,图9)。

图5 细胞免疫荧光染色观察BMSCs中Mage-D1的表达

图6 BMSCs沉默Mage-D1后的慢病毒转染验证

a:P<0.01,与sh-NC组比较A:RT-qPCR检测Mage-D1的表达；B: Western blot检测Mage-D1的蛋白表达；C: 蛋白表达半定量分析

图7 Mage-D1对BMSCs细胞周期、增殖和迁移的影响

图8 Mage-D1对BMSCs矿化能力的影响

图9 RT-qPCR检测沉默Mage-D1后BMSCs中矿化相关基因的表达水平

3、讨论

Mage-D1作为Ⅱ型黑色素瘤相关抗原基因家族的新成员，参与细胞的多种生物活动，如细胞分化、迁移、增殖、周期、凋亡和转录调控等[3-7],在多种组织中均有表达[11]。近年的研究表明，Mage-D1与骨生物学密切相关，作为一种多功能接头蛋白，Mage-D1被认为可与多种蛋白相互作用，从而积极参与骨代谢过程[12-13]。然而，关于Mage-D1对骨骼发育的体内研究证据仍然缺乏，因此本项目通过构建Mage-D1敲除小鼠，提供了Mage-D1影响骨骼发育的直接证据。在繁育小鼠的过程中发现所产生的纯合子子代小鼠性别限定为雄性，无法观察到雌性的纯合子小鼠。文献回顾发现，DOMBRET等[14]也观察到同样现象，这可能是由雄性Mage-D1敲除小鼠性行为缺陷引起。在实验过程中首先对Mage-D1敲除小鼠的基因型进行了鉴定，并验证了敲除效率，结果表明构建的敲除小鼠确为Mage-D1敲除纯合子小鼠，且Mage-D1在股骨骨组织中的表达极低。Mage-D1敲除小鼠的成功构建为后续实验奠定了基础。解剖Mage-D1敲除小鼠和同窝野生型小鼠股骨，对Mage-D1敲除小鼠和同窝野生型小鼠股骨大小进行了目视观察，发现不同窝小鼠之间股骨大小不同，而同窝Mage-D1敲除小鼠股骨与野生型小鼠股骨的大小无明显差异。随后，对Mage-D1敲除小鼠股骨骨量进行了探讨，Micro-CT扫描结果表明敲除小鼠的皮质骨厚度及矿物含量、松质骨矿物含量及表面密度均明显降低，骨小梁数量减少，而骨小梁的分离度增加，提示Mage-D1可能参与了小鼠股骨发育矿化的调控，Mage-D1敲除后降低了骨组织的骨量。既往研究显示Mage-D1敲除鼠股骨的骨密度显著降低，骨微结构恶化，存在骨缺失表型[8],与本实验结果一致。因此，Mage-D1可能对小鼠股骨骨组织的发育矿化具有重要的促进作用。

然而，骨组织在不断经历着改建与重塑的过程，其主要组成成分是钙、磷酸盐以及多种激素，在体内也具有调节骨矿化的作用[15]。其中，降钙素和甲状旁腺素对血清钙浓度起着重要的调节作用，维持了血钙的稳态[16]。因此，为了明确Mage-D1对小鼠股骨矿化的实际意义，本实验进一步提取了两种基因型小鼠的血清进行检测，比较敲除小鼠和野生小鼠血钙、血磷、降钙素和甲状旁腺素的水平变化。结果表明血钙、血磷、降钙素及甲状旁腺素水平在两种基因型小鼠中均无显著差异，提示Mage-D1敲除后小鼠股骨骨量的减少并非是因其体内钙、磷变化引起的。骨重建是一个骨形成和骨吸收动态平衡的过程，Mage-D1基因敲除可能通过抑制成骨能力减少骨的形成或促进破骨吸收导致小鼠股骨骨量减少。研究表明，Mage-D1可诱导β-catenin的核转运并增强其DNA结合能力，从而调控经典成骨信号通路wnt通路[17],提示Mage-D1可能参与调控成骨从而促进成骨增加。此外，LIU等[8]发现对Mage-D1敲除小鼠的单核/巨噬细胞进行体外诱导后，与对照组相比TRAP阳性破骨细胞的数量和面积显著增加。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为一种骨髓来源的间充质干细胞，具有多向分化潜能，包括分化为成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞和软骨细胞[18],且在体外易于获取并扩大培养，因此被认为是用于骨组织工程的种子细胞[19]。与黑色素瘤抗原基因(Mage)家族其他蛋白质在正常成体组织中低表达的情况不同，Mage-D1在正常组织中普遍表达[2],也广泛存在于外胚间充质干细胞、成骨细胞、神经元细胞及肿瘤细胞等细胞类型中[20-21]。然而，Mage-D1在BMSCs中的表达情况尚不清楚，其对BMSCs增殖、迁移等生物学特性和矿化能力的影响也尚不明确。本实验通过免疫荧光染色观察到Mage-D1在BMSCs的胞核及周围区域高表达。而在前期实验中，通过慢病毒转染BMSCs过表达Mage-D1,发现Mage-D1表达仅提高到原始水平的1.2倍，始终无法达到2倍的转染效率[22],无法建立Mage-D1过表达模型，这可能与Mage-D1在BMSCs中高表达有关。随后使用慢病毒转染的方法来探究Mage-D1沉默后对BMSCs增殖、迁移、细胞周期及矿化能力的影响。研究表明当目标基因表达减少到原始水平的50%～75%时即为有效沉默[23],本实验RT-qPCR及Western blot结果显示慢病毒转染后BMSCs中Mage-D1的基因及蛋白表达水平均减少到原始水平的50%左右，表明成功构建了Mage-D1沉默的细胞株。

骨发育中，骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和矿化是一个互相关联、动态调控的过程，细胞增殖为基质合成和矿化奠定基础，迁移确保细胞能达到骨重建部位，而矿化最终完成骨组织的形成和功能恢复[24-26]。本实验探讨了Mage-D1沉默后对BMSCs增殖、周期和迁移能力的影响。采用CCK-8增殖试剂盒检测了细胞在第0～7天的生长情况，结果表明从第1天起，Mage-D1沉默组细胞的增殖能力便明显受到抑制，这与QI等[27]学者在小鼠牙髓细胞中的实验结果一致，该研究还指出Mage-D1可能通过调控NF-κB信号通路参与调控小鼠牙髓细胞的增殖。由于细胞的增殖能力与其所处的细胞周期密切相关[28],本实验进一步检测了细胞周期情况，结果显示Mage-D1沉默后增加了处于G1期和G2期的BMSCs细胞数量，而处于S期的细胞数量减少，表明沉默Mage-D1后细胞主要停滞在了细胞分裂的间隙期，使得细胞的增殖分裂能力减弱。细胞划痕实验结果显示Mage-D1沉默组细胞迁移速度明显增快，表明Mage-D1负向调控BMSCs的迁移能力，与Mage-D1在Hela细胞、胰腺癌细胞等肿瘤细胞中表现出的迁移抑制作用相一致[29-30]。

本研究通过动物实验发现了Mage-D1敲除小鼠股骨骨量降低，从而确定了Mage-D1对骨量的重要意义，然而骨量多少是由骨形成和骨吸收共同决定[31]。为了进一步研究Mage-D1对骨形成中矿化的影响，本研究从细胞水平验证了Mage-D1对矿化的调控作用。通过转染慢病毒降低BMSCs中Mage-D1表达，然后检测BMSCs的矿化能力及矿化相关因子的表达水平，以此来评价Mage-D1在BMSCs矿化中的调控作用。ALP、Runx2、Col1等都是矿化相关标志物，其中Runx2是一种矿化相关特异性转录因子，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[32];ALP和Col1在成骨细胞诱导过程中表达增加[33]。因此，本研究检测了ALP、Runx2、Col1这3个矿化相关因子，实验结果显示，与对照组相比，沉默Mage-D1后BMSCs内ALP、Runx2、Col1的基因表达量和蛋白表达量均下调。同时碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示，Mage-D1沉默组碱性磷酸活性和钙结节形成能力减弱，这些结果说明Mage-D1正向调控BMSCs的矿化能力。这与以往研究发现相一致，敲低Mage-D1后来自颅骨的成骨细胞矿化诱导后钙结节减少[34],过表达Mage-D1后外胚间充质干细胞矿化能力升高，以及沉默Mage-D1后外胚间充质干细胞矿化能力下降[19]。然而，敲低Mage-D1后提高了小鼠牙髓细胞矿化能力[27]。这可能与Mage-D1与多种核蛋白、转录因子、细胞表面受体相互作用，对不同细胞具有不同调控机制有关。p75NTR属低亲和力神经营养因子受体，可以上调homeobox基因家族成员Dlx/Msx并促进外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells, EMSCs)的成骨分化与矿化[35-36]。本课题组前期研究发现Mage-D1在p75NTR-Dlx1/Msx1信号轴传导过程中起重要作用[20,37],本研究针对BMSCs的检测结果，显示Mage-D1可正向调控p75NTR和Msx1表达，与以往研究结果一致，提示Mage-D1对骨代谢活动的调控可能通过p75NTR- Dlx1/Msx1信号轴起作用。

综上所述，Mage-D1对小鼠股骨的骨量具有正向调控作用，并且Mage-D1对BMSCs的生物学特性和矿化能力也具有调控作用。具体表现在Mage-D1能够抑制BMSCs的迁移能力，增强其增殖能力，并促进BMSCs的矿化，提示Mage-D1可能是治疗骨发育不全、预防骨质疏松等临床疾病的重要分子靶点。

参考文献:

[37]罗玉婷,杨正艳,李蒙,等.Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化[J].南方医科大学学报,2021,41(10):1547-1553.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81970906)~~;

文章来源:陆明洁,袁洪燕,徐丹,等.Mage-D1对敲除小鼠骨髓间充质干细胞的矿化调控作用[J].陆军军医大学学报,2024,46(18):2069-2080.