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山东某种鸡群禽白血病流行情况研究

2024-08-18 16 上传者：管理员

摘要：为了解山东某地方品种鸡群的禽白血病流行情况，本研究采集了种鸡的血清475份、泄殖腔棉拭子1 201份和疑似病例8例，分别进行了血清学、病理学及病原学检测。结果显示，鸡群的抗原阳性率为33.39%,ALV-A/B亚群抗体阳性率为16.21%；病理学诊断结果显示肿瘤类型主要为髓细胞瘤；从疑似病例分离到8株ALV-J，病毒gp85基因同源性为97.4%～99.2%，与ALV-J原型株HPRS103gp85基因同源性为95.9%～97.2%，与其他已发表的ALV-J分离株gp85基因的同源性为94.2%～97.9%；分离到3株ALV-A，病毒env基因同源性为94.5%～97.9%。本研究结果表明，该种鸡场ALV-A和ALV-J同时存在，不能确定ALV-B是否存在，需要做进一步的调查研究。

关键词：
ALV
ELISA
流行病学
病原体
禽白血病
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在20世纪80年代鸡群中存在禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）感染，其中ALV-A是主要的病原体，主要感染蛋鸡，B亚群次之[1-3]，经过种鸡公司的净化，此类亚群病例的报道较少。J亚群是英国的Payne等于1988年从白羽肉鸡中首次分离得到的，之后有学者研究发现ALV-J的gag基因与pol基因具有高度同源性，并最终证实了ALV-J是内源性ALV-E与外源性ALV的基因重组变异株[4-5]。该病在国内流行，并且对养禽业造成巨大经济损失。近年来，山东某地方品种鸡产蛋率低，其后代杂交鸡出现生长迟缓、发育不良的现象，疑似存在ALV感染，已经严重威胁到该种鸡群的健康生产。为了解该种鸡群ALV的流行情况，对该病进行了血清学、病原学及病理学研究。

1、材料和方法

1.1 材料

被检样品来源：山东某种鸡场现存种鸡近3万套，其中原种公鸡、原种母鸡、杂交公鸡、杂交母鸡四个鸡群。被检样品分别包括血清475份、泄殖腔棉拭子1 201份以及8例疑似病例。疑似病例均来自杂交鸡群，日龄在340～430 d。

1.2 方法

1.2.1 ALV-A/B、ALV-J抗体和P27抗原检测

采用ELISA检测血清中的ALV-A/B、ALV-J抗体和泄殖腔棉拭子中的P27抗原，ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司。

1.2.2 病理组织学观察

将送检或采集的阳性鸡或病鸡记录编号，外部检查，剖检并记录大体病变。取待检鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和鸡冠等组织，于福尔马林液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察。

1.2.3超薄切片样品的制备

取待检鸡的脾脏、脾脏等组织，切成1 mm3大小，2.5%戊二醛固定2 h,l%锇酸后固定2 h，梯度酒精脱水，无水丙酮替换，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色。在透射电镜下观察并记录超微结构变化。

1.2.4 聚合酶链式反应（PCR）检测

根据Gen Bank中登录的HPRS103(Z46390.1）、SDAU09C1(HM452339.1）和SDAU09C2(HM446005.1）的基因序列，分别设计并合成3对引物，用于检测ALV-J及ALV-A、ALV-B。将PCR产物回收，连接至p MD18-T载体，转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆测序，与Gen Bank中的已发表毒株序列进行同源性比较。

2、结果

2.1 鸡群中的禽白血病流行情况

各鸡群P27抗原及ALV-A/B抗体均有阳性，阳性率分别为33.39%和16.21%;ALV-J抗体的阳性率为0。各鸡群的抗原阳性率不尽相同，其中以杂交公鸡的抗原阳性率为最高（表1）。检测结果表明，山东地方品种鸡各鸡群普遍存在ALV的感染。

表1该场各鸡群禽白血病抗原与抗体水平

2.2 临床症状及剖检病变

疑似病例均来自杂交鸡群，多数鸡生长发育不良，产蛋率偏低、死亡率高。临床症状主要有精神沉郁、食欲不振等，有的病鸡表现精神萎靡，羽毛凌乱，鸡冠上有肉芽肿和肿瘤结节等症状（图1A）。肝有不同程度的肿大，表面可见多处弥散性分布的灰白色肿瘤结节（图1B）。脾脏明显肿大，表面可见灰白色肿瘤结节，大小不一，直径约为0.1～1 cm（图1C）。

图1病鸡临床症状及眼观病变

2.3 病鸡的病理变化

多数病例为髓样细胞瘤，各组织器官均有不同程度的髓样瘤细胞浸润增生。心肌组织中间偶尔可见大量的组织细胞型浸润，通常聚集在心肌组织切片的边缘（图2A）。肝脏实质区瘤细胞成片增生，可见非常典型的红色嗜酸性颗粒，挤压正常肝索组织，致其消失或排列紊乱。这些髓样瘤细胞，形态较一致，胞体较大、圆形，胞浆嗜碱性；胞核空泡化，核分裂象多样，可见不对称、不规则、环状分裂等病理性核分裂像（图2B）。脾脏大量瘤细胞弥漫性浸染，脾脏结构模糊；髓样瘤细胞胞核病理性核分裂象多见，胞体变圆、胞核空泡化（图2C）。肺泡周围有数量较多的髓样瘤细胞，挤压并破坏正常肺泡组织（图2D）。肾脏的肾小管之间有大量圆形或椭圆形、胞质嗜碱性呈局灶性或弥漫样增生的髓样瘤细胞。这些髓样瘤细胞，形态较一致，胞体较大、圆形；胞核空泡化，多呈核分裂像（图2E）。鸡冠：鸡冠组织中可见大量髓样瘤细胞，挤压正常组织（图2F）。

图2病鸡组织病理学变化（HE染色，1 000×）

2.4 超微病理学变化

肝脏中大部分正常细胞消失或凋亡，大量髓细胞样瘤细胞出现其中。肝细胞脂肪滴普遍存在，呈线型排列（图3）；肝细胞胞浆中的病毒粒子紧贴细胞膜，约100 nm（图4）；部分肝脏细胞核膜破坏，病变细胞中出现大液泡，有变形的异染色质边集；内质网池变大，出现板层状产物；细胞中的线粒体外膜被溶解破坏，糖元聚集。其中可见大量肿瘤细胞内有许多液泡，在液泡边缘有病理性产物，呈黑色颗粒；细胞核内异染色质增多，呈核分裂象。脾脏细胞核膜水肿，线粒体水泡化，脊变小，脾脏细胞中内质网脱颗粒，池变大，水泡化。其中的淋巴细胞里面存在蛋白颗粒，约600 nm，可能是代谢异常的产物。

图3病鸡肝脏细胞脂肪滴聚集

图4细胞质内存在病毒粒子

2.5 病原学检测结果

病原学检测结果显示，8份病料中ALV-J均为阳性（阳性率100%),ALV-A有3份为阳性（阳性率37.5%),ALV-B为阴性（阳性率为0）。结果表明，山东某地方品种鸡群主要是以ALV-J的感染为主。各分离株ALV-J gp85基因的同源性比较和遗传进化分析结果显示，SG101、SG102、SG103、SG104、SG105、SG106、SG107和SG108这8个分离株之间的同源性为97.4%～99.2%；与8株国内外参考株的同源性为94.2%～97.9%，其中与ALV-J原型株HPRS103 gp85基因同源性最高，为95.9%～97.2%。分离到3株ALV-A，病毒env基因同源性为94.5%～97.9%。

3、讨论与结论

本调查结果显示，山东该地方品种鸡普遍存在外源性ALV感染。随着致病力强的ALV-J的出现该病广为传播，加之该病又无疫苗免疫，其感染鸡群不断出现患瘤死亡鸡、生产性能下降[3]和免疫抑制，给养殖业造成了严重损害，并增加了该地方品种鸡保种的困难。垂直传播可导致鸡出现病毒血症而无抗体产生的免疫耐受感染，只有当免疫耐受鸡克服了耐受状态之后，才能产生抗体[6-8]。

ALV-J主要感染骨髓细胞，产生髓细胞样瘤细胞，在组织切片检测到了髓样瘤细胞，这与PCR检测结果呈阳性一致。提示可以通过组织病理学观察来初步确定ALV-J的感染[9]。杂交鸡是由该原种鸡与进口白羽肉鸡杂交而来的，也就是说ALV-J可能来自进口白羽肉鸡；同源性分析也表明，这8个分离株与ALV-J原型株HPRS103 gp85基因同源性最高。现在还不能确定是否有ALV-B的存在，需要做进一步的调查研究。近年来，致瘤性病毒的共感染现象已相当普遍，国外进口的肉鸡、蛋鸡均检测到致瘤病毒的双重或多重感染[10-14]。多种致瘤的免疫抑制病毒共同感染可协同作用，致病力及免疫抑制作用显著加强[15]。肿瘤性病毒混合感染，也是造成鸡免疫失败愈来愈严重的原因之一[16-18]。

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