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瞬时受体电位通道5对间歇性低氧致心肌焦亡的影响

2024-06-17 20 上传者：管理员

摘要：目的探讨瞬时受体电位通道5(TRPC5)对间歇性低氧致心肌焦亡的影响。方法 TRPC5-/-大鼠及SD大鼠各12只，两种大鼠分别随机分为慢性间歇性低氧组(CIH组)和常氧组(Control组)，即WT-Control组、WT-CIH组、TRPC5-/--Control组、TRPC5-/--CIH组，每组6只。通过Masson染色观察大鼠心肌纤维化情况，ELISA检测血清炎症因子水平，Western blot检测TRPC5及焦亡相关蛋白相对表达水平。结果 Masson染色显示，TRPC5-/--CIH组胶原容积分数高于TRPC5-/--Control组，低于WT-CIH组。ELISA结果显示，TRPC5-/--CIH组血清IL-1、IL-6、TGF-β水平高于TRPC5-/--Control组，低于WT-CIH组。Western Blot结果显示，TRPC5-/--CIH组焦亡相关蛋白Caspase-1、NLRP3、GSDMD、GSDMD-N相对表达量高于TRPC5-/--Control组、低于WT-CIH组。结论 TRPC5缺乏减轻间歇性低氧导致的心肌焦亡，并改善心肌纤维化。

关键词：
OSAHS
炎症因子
焦亡
瞬时受体电位通道5
间歇性低氧
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阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrom,OSAHS）以睡眠时上呼吸道梗阻、气流减少、反复呼吸暂停为特征[1]，导致睡眠中断、间歇性低氧、胸腔内压力改变、交感神经过度激活等不良后果[2]，是心血管疾病的重要危险因素[3,4]。间歇性低氧、活性氧（reactive oxygen species,ROS）形成以及氧化应激是OSAHS的标志[5]，尤其是ROS的积累，不仅促进炎症反应[6]，而且会使Ca2+稳态失衡[7]，促进心肌损伤的发生[8]，造成不良心血管事件，严重影响患者生活质量和寿命。

细胞焦亡被称为细胞炎症性坏死，其特点是质膜破坏，并释放细胞内容物和促炎因子IL-1β、IL-18[9]，在心血管疾病中发挥重要作用[10]。研究表明，间歇性低氧通过细胞焦亡促进肾损伤[11]及脑损伤[12]，但是细胞焦亡在OSAHS心肌损伤中的确切作用及机制尚不清楚。

经典瞬时受体电位通道5(canonicaltransient receptor potential channels,TRPC5）是存在于中枢神经系统、肾脏及心血管系统[13]的非电压门控Ca2+通道[14]，参与焦虑、抑郁、癫痫等神经系统疾病及慢性肾脏病的进展[15]，但其与心血管疾病的相关研究甚少。间歇性低氧促进大鼠心肌组织中TRPC5表达[16]，且促进心肌焦亡[17]，但间歇性低氧中，TRPC5与心肌焦亡的关系并未阐明，故本研究探讨TRPC5对间歇性低氧大鼠心肌焦亡的影响，以期为OSAHS心肌损伤防治的新靶点提供理论依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

雄性TRPC5-/-及SD大鼠各12只，8～10周龄，体质量180～220 g，由赛业生物科技有限公司提供，动物许可证编号：SCXK（粤）2020-0055。常温下，普通饲料饲养，自由饮水及进食，造模前适应性饲养1周。本研究经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准通过，审批号：IACUC-20210326-08。

1.2主要试剂与仪器

快速Masson染液（D026-1）购自南京建成科技有限公司；Rat IL-1βELISA Kit(EK301B/2-48）、Rat IL-6 ELISA Kit(EK306/3-48）、Rat TNF-αELISA Kit(EK382/3-48）购自联科生物；GSDMDC1抗体（H-11)(sc-393581）购自美国Santacruz公司；Anti-TRPC5抗体[S67-15](ab240872）、重组Anti-pro Caspase-1+p10+p12抗体[EPR16883](ab179515）、重组Anti-NLRP3抗体[EPR23094-1](ab263899）、山羊抗兔Ig G H&L(HRP)(ab205718）、山羊抗小鼠Ig G H&L (HRP)(ab205719）购自英国Abcam公司。酶标仪（x MarkTM）购自Bio-Rad（中国）公司；化学发光成像仪系统（Chemiscope 3000）购自上海勤翔科学仪器有限公司；微量分光光度计（Nano-100）购自杭州奥盛仪器有限公司；凝胶成像系统（2500）购自上海天能科技有限公司。

1.3动物分组及造模

将大鼠随机分为WT-Control组、WT-CIH组、TRPC5-/--Control组、TRPC5-/--CIH组（每组各6只）。将WT-CIH组和TRPC5-/--CIH组置于间歇性低氧舱，每天10:00-18:00向舱内循环充入氮气、氧气。充入氮气90 s，当舱内氧浓度达6.5%时维持30 s，随后60 s排出舱内气体，氧浓度上升到21%持续60 s，为1个循环，每天持续8 h，建模8周[16]。WT-Control组和TRPC5-/--Control组置于常氧舱内，提供常氧空气。8周后用氯胺酮将大鼠麻醉后开胸，将头皮针刺入大鼠右心室取血，后将大鼠心脏完整取出。

1.4检测指标与方法

1.4.1心脏结构及功能检测

造模结束24 h内，大鼠称重后用氯胺酮麻醉。采用PHILIPS公司HD11XE超声诊断仪S12-4超声探头（频率12 MHZ）行超声心动图检查，测量各组大鼠左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短轴缩短率（fractional shortening,FS）、左室舒张末期容积（end-diastolic volume,EDV）和室间隔舒张期厚度（Interventricular septum end diastolic thickness,IVSd）。

1.4.2心肌纤维化检测

大鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后进行Masson染色观察各组大鼠心肌纤维化情况，用Image J计算胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）。

1.4.3 ELISA检测血清炎症因子

各组大鼠血液凝固后离心取上清获得血清，使用Rat IL-1βELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit、Rat TNF-αELISA Kit，按说明书测定各组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。1.4.4左心室心肌组织TRPC5及焦亡相关蛋白表达检测用Western blot检测各组大鼠左心室心肌组织TRPC5和焦亡相关蛋白Caspase-1、NLRP3、GSDMD、GSDMD-N表达水平。左室心肌组织RIPA裂解液提取总蛋白，BCA方法进行蛋白定量。电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭。加入TRPC5抗体（1∶800）、Caspase-1抗体（1∶800）、NLRP3抗体（1∶600）、GSDMD抗体（1∶200）、β-actin抗体（1∶1 000)4℃冰箱中孵育过夜。次日TBST洗膜，以HRP标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，显色、拍照。用Image J软件分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.5统计学方法

用SPSS 24统计软件对数据进行处理，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TRPC5缺乏减轻间歇性低氧导致的心脏结构及功能变化

心脏彩超结果显示，与WT-control组相比，WT-CIH组LVEF、FS下降，而IVSd、EDV升高（P<0.05）。TRPC5-/--CIH组LVEF、FS低于TRPC5-/--Control，而IVSd及EDV高于TRPC5-/--Control组（P<0.05）。见图1。

2.2 TRPC5缺乏减轻间歇性低氧导致的心肌纤维化

Masson染色显示，与WT-Control组比较，WT-CIH组心肌间质蓝染面积增加，胶原容积分数度显著升高（P<0.05）；与TRPC5-/--Control组比较，TRPC5-/--CIH组心肌间质蓝染面积增加，胶原容积分数升高（P<0.05）；与WT-CIH组比较，TRPC5-/--CIH组心肌间质蓝染面积减少，胶原容积分数下降（P<0.05）。见图2、表1。

图1各组大鼠心脏彩超结果

图2 Masson染色结果（×200)

表1各组大鼠心肌胶原容积分数下

2.3 TRPC5缺乏减轻间歇性低氧诱导的炎症反应

ELISA结果显示，WT-CIH组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α高于WT-Control组（P<0.05）。TRPC5-/--CIH组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α高于TRPC5-/--Control组、低于WT-CIH组（P<0.05）。见表2。

2.4 TRPC5缺乏减轻间歇性低氧导致的心肌细胞焦亡

Western blot结果显示，WT-CIH组大鼠心肌组织焦亡蛋白Caspase-1、NLRP3、GSDMD表达水平高于WT-Control组（P<0.05）。TRPC5-/--CIH组大鼠心肌组织中焦亡蛋白Caspase-1、NLRP3、GSDMD表达水平高于TRPC5-/--Control组、低于WT-CIH组（P<0.05）。见图3、表3。

表2各组大鼠血清炎症因子检测结果

3、讨论

本研究中，我们探讨了TRPC5对间歇性低氧致炎症反应、心肌细胞焦亡、心肌纤维化及心脏结构功能的影响。结果表明，TRPC5缺乏可以下调间歇性低氧大鼠血清炎症因子表达，减轻心肌细胞焦亡、心肌纤维化及心肌结构功能损伤。因此，靶向抑制TRPC5可能是OSAHS患者心肌损伤的一种治疗策略，可能通过抑制间歇性低氧诱导的促炎细胞因子和心肌细胞焦亡而发挥作用。

焦亡是一种程序性细胞死亡，伴随着炎症反应的发生[18]。炎症小体是焦亡信号通路中的重要组成部分，通过模式识别受体激活，使procaspase-1转化为具有酶活性的Caspase-1，活化的Caspase-1一方面促进炎症因子IL-β和IL-18的释放，另一方面切割GSDMD，促进膜孔形成，导致细胞焦亡[19]。研究[20]表明，焦亡通过炎症参与动脉粥样硬化、缺血性心肌病、高血压性心脏病、血栓栓塞等心血管疾病。TRPC5是瞬时受体电位通道的一员，作为一种Ca2+通透性阳离子通道，存在于脑、心血管、肾脏、肝脏等组织[21]，参与多种疾病的发生[22]。证据表明，TRPC5通过炎症反应促进多种疾病的进展。TRPC5缺失降低糖尿病小鼠血清炎及心肌组织症因子水平，降低血糖，并改善心肌损伤[23]。抑制TRPC5可以减轻创伤性脑损伤海马组织的氧化应激及炎症反应，减少神经元细胞死亡，并改善由此引起的认知功能障碍[24]。这些研究表明，TRPC5可能参与细胞焦亡，但相关研究甚少。本研究发现，TRPC5缺乏，下调血清炎症因子水平，并抑制焦亡相关蛋白表达，因此，TRPC5可以作为细胞焦亡调控的新靶点。

图3 Western blot检测结果

表3各组大鼠心肌组织TRPC5及焦亡相关蛋白相对表达量

心肌纤维化以心肌间质中细胞外基质蛋白的过度积累为特征，参与多种心脏疾病的病理生理学变化，是心肌重构的重要形式。活化的成纤维细胞及肌成纤维细胞，通过促进基质蛋白、基质金属蛋白酶等的产生及细胞外基质胶原沉积，促进心肌纤维化进展[25]，最终导致心脏结构及功能损伤。研究表明，炎症反应及TRPC5参与心肌纤维化的发展。抑制NLRP3及炎症反应，可以减轻阿霉素诱导心肌损伤小鼠的心肌纤维化[26]。抑制炎症反应，可以改善心肌梗死小鼠的心肌纤维化及心功能[27]。TRPC5通过Ca2+稳态失衡，调控炎症反应，减轻缺血再灌注损伤导致的心肌纤维化[28]。TRPC5缺乏，减轻糖尿病心肌病小鼠的心肌纤维化[23]。本研究结果显示，间歇性低氧促进心肌纤维化，抑制TRPC5减轻了间歇性低氧导致的心肌纤维化，并抑制炎症因子水平，这些结果表明，TRPC5可能通过促进炎症反应调控间歇性低氧导致的心肌纤维化。

综上所述，抑制TRPC5能减轻间歇性低氧导致的心肌焦亡及心肌纤维化，表明TRPC5可以作为间歇性低氧心肌损伤防治的潜在靶点，但具体机制并未阐明，推测可能与炎症反应相关，在后续的研究中进一步探讨。

参考文献:

[17]李瑜,古丽娜孜·吐拉洪,陈玉岚,等.慢性间歇性低氧对OSAHS大鼠心肌细胞焦亡的影响[J].山东医药,2023,63(7):38-41.

[23]崔艺璇,周翔,刘宽,等.瞬时受体电位通道蛋白5对糖尿病性心肌病炎症的调节作用[J].中国药理学通报,2022,38(2):201-208.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:82060058);

文章来源:邱璇,沙热扎提·依沙江,陈玉岚,等.瞬时受体电位通道5对间歇性低氧致心肌焦亡的影响[J].实用医学杂志,2024,40(12):1637-1642.