蓝莓被广泛认为是从自然资源中提取紫檀芪(pterostilbene,PTE)的理想来源。紫檀芪，作为白藜芦醇的甲氧基化衍生物，存在于多种浆果中，尤以蓝莓为著，其对多种疾病包括糖尿病、心血管疾病和脂肪肝等具有潜在的治疗作用(Kim et al.,2020;Özyal-çın and Sanlier,2023)。紫檀芪因其独特的结构特征，如额外的甲基和独特的游离羟基，具有较高的亲脂性，从而在生物利用度(高达95%)、膜通透性及代谢稳定性方面超越了白藜芦醇(Akinwumi et al.,2018;Lange and Li,2018)。这种独特的特性使得紫檀芪在抗氧化、抗炎和抗菌作用方面展现出较白藜芦醇更为显著的生物活性(Yang et al.,2017)。

在动物模型的实验中，紫檀芪已被证实对各种应激条件具有保护作用，并通过激活Nrf2和AMPK/mTOR信号通路，改善脂代谢和抗氧化状态(Zhang et al.,2020;Shen et al.,2023;Zhang et al.,2024)。尽管其在治疗高脂血症(hyperlipidemia,HLP)方面的潜力被假设为有价值，但相关研究仍然有限。

高脂血症，作为一种常见的代谢性疾病，随着生活方式的改变在全球范围内逐渐增加，尤其是在老年人群中(Mahemuti et al.,2023)。由于药物治疗可能导致的不良反应，探索结合改变生活方式的综合治疗方法变得尤为重要(Walsh and Pignone,2004;Pearlman et al.,2017)。耐力运动作为一种有效的生活方式干预，已被证明能改善脂代谢和降低氧化损伤(Ratajczak et al.,2019)。

本研究旨在探讨紫檀芪联合耐力运动对老年高脂血症大鼠脂代谢的影响，旨在为高脂血症的防治提供新的思路和证据。通过分析紫檀芪与耐力运动干预的效果，本研究进一步证实了紫檀芪的潜在价值，并为其在临床应用中的潜在利用提供了科学依据。

1、结果与分析

1.1紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠血脂代谢的影响

与正常对照组(NC组)相比，高脂血症(HLP)模型组的大鼠显示出总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平的显著升高，以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平的显著降低(P<0.05)(图1)，表明成功建立了高脂血症模型。

在与HLP模型组相比较时，我们发现紫檀芪联合耐力运动(HLP+EE组)、紫檀芪低剂量(HLP+20P-TE组)、中剂量(HLP+40PTE组)、高剂量(HLP+80P-TE组)以及紫檀芪高剂量联合耐力运动(HLP+EE+80PTE组)的治疗组在TC、TG和LDL-c水平上均有显著下降，而HDL-c水平则有显著上升(P<0.05)。这些结果提示紫檀芪配合耐力运动能有效改善老年高脂血症大鼠的脂代谢失衡状态。

图1紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠血脂代谢的影响

尤其是与单独紫檀芪治疗组(HLP+PTE组)和单独耐力运动组(HLP+EE组)相比，紫檀芪高剂量联合耐力运动的组合治疗(HLP+EE+80PTE组)在TC、TG和LDL-c水平的降低以及HDL-c水平的提升方面表现出更为显著的效果(P<0.05)。这一发现进一步强调了紫檀芪和耐力运动协同作用在调节老年高脂血症大鼠血脂代谢方面的潜力。

1.2紫檀芪和耐力运动对老年高脂血症大鼠肝脏结构的影响

肝脏染色(图2)结果揭示了各组大鼠肝脏的形态变化。在对照组(NC组)中，大鼠的肝脏结构保持正常，未观察到明显的病理变化。然而，高脂血症(HLP组)大鼠展现出显著的肝脏细胞退化、细胞排列不规则、肝细胞出现空泡化现象、肝窦的扩张以及脂肪滴的积累和大量炎症细胞的浸润，这些变化标志着显著的肝脏损伤。

进一步分析紫檀芪与耐力运动联合处理组(即HLP+EE组,HLP+20PTE组,HLP+40PTE组,HLP+80PTE组及HLP+EE+80PTE组)的结果表明，这些治疗策略显著改善了肝脏的形态损伤。在HLP+EE+80PTE组中，大鼠的肝脏结构几乎完全恢复到正常水平，显示出细胞排列规整、减少的空泡化现象、正常的肝窦以及显著减少的炎症细胞和脂肪滴积累。

这些发现强调了紫檀芪联合耐力运动在缓解老年高脂血症大鼠肝脏损伤中的潜在益处。联合使用最高剂量的紫檀芪和耐力运动显示出最为明显的恢复效果，这可能指示了一个协同的作用机制，为未来的临床研究和治疗策略提供了重要的基础。

1.3紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏抗氧化系统的影响

抗氧化结果(图3)展示了紫檀芪联合耐力运动对老年高脂血症(HLP)大鼠肝脏抗氧化指标的影响。结果显示，在正常对照组(NC组)与高脂血模型组(HLP组)之间，HLP组的肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平呈显著下降趋势，而丙二醛(MDA)水平则显著升高(P<0.05)，暗示高脂血状况下老年大鼠肝脏的抗氧化能力受损。

进一步，与单纯高脂血模型组相比，经过耐力运动治疗(HLP+EE组)、不同剂量紫檀芪处理(HLP+20PTE,HLP+40PTE,HLP+80PTE组)以及紫檀芪与耐力运动联合治疗(HLP+EE+80PTE组)的大鼠，其肝脏的GSH-Px、GSH、SOD和CAT水平显著提升，MDA水平则显著降低(P<0.05)。这一变化表明，紫檀芪和耐力运动能有效提升老年HLP大鼠肝脏的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤。

然而，与单独耐力运动治疗组(HLP+EE组)和单独紫檀芪治疗组(H+PTE组)相比，联合使用最高剂量紫檀芪和耐力运动的治疗组(HLP+EE+80PTE组)在提升肝脏GSH-Px、GSH、SOD和CAT水平以及降低MDA水平方面显示出更显著的效果(P<0.05)。这一发现强调了紫檀芪与耐力运动联合干预对于改善老年高脂血症大鼠肝脏抗氧化系统失衡的潜在协同效应。

可见，本研究证实了紫檀芪联合耐力运动可有效改善老年高脂血症大鼠肝脏的抗氧化防御机制，为高脂血症的辅助治疗提供了新的实验依据。

1.4紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏脂代谢基因的影响

肝脏脂代谢结果显示(图4)在高脂血症(HLP)大鼠中，肝脏中SREBP1c、ACC-1、FAS、FATP5、CD36mRNA的相对表达水平与正常对照组(NC组)相比显著升高(P<0.05)，这说明高脂血症状态下肝脏脂代谢基因的转录活性增加。

进一步分析表明，与仅有高脂血症的HLP组相比，进行耐力运动(HLP+EE组)、接受20 mg紫檀芪处理(HLP+20PTE组)、40 mg紫檀芪处理(HLP+40PTE组)、80 mg紫檀芪处理(HLP+80PTE组)以及耐力运动加上80 mg紫檀芪处理(HLP+EE+80PTE组)的大鼠，在肝脏中SREBP1c、ACC-1、FAS、FATP5、CD36 mRNA的相对表达水平均有显著降低(P<0.05)。

图2大鼠的肝脏HE染色(×200)

图3紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏抗氧化系统的影响

图4紫檀芪联合耐力运动干预下老年HLP大鼠肝脏脂代谢基因表达变化

值得注意的是，当将耐力运动与80 mg紫檀芪处理相结合(HLP+EE+80PTE组)时，相比于仅接受耐力运动(HLP+EE组)或紫檀芪处理(H+PTE组)的大鼠，肝脏中SREBP1c、ACC-1、FAS、FATP5、CD36mRNA的相对表达水平进一步显著降低(P<0.05)。这一结果表明，紫檀芪的加量配合耐力运动，能够更有效地纠正老年高脂血症大鼠肝脏脂代谢基因的异常转录活性。

综上所述，紫檀芪结合耐力运动对于改善老年高脂血症大鼠的肝脏脂代谢具有积极影响，尤其是当两者结合使用时，对肝脏脂代谢基因表达的正向调节作用更为显著。

1.5紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏Nrf2/Keap1通路的影响

Nrf2/Keap1通路图中，本研究观察到相比于正常对照组(NC组)，高脂血症(HLP)组的大鼠肝脏中，核因子E2相关因子2 (nNrf2)的蛋白表达水平显著下降，而Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)的蛋白表达水平显著上升(P<0.05)(图5)，揭示了高脂血状态对肝脏Nrf2/Keap1信号通路的负面影响。

进一步分析发现，仅与HLP组相比，耐力运动组(HLP+EE)、不同剂量紫檀芪处理组(HLP+20PTE,HLP+40PTE,HLP+80PTE)以及紫檀芪最高剂量联合耐力运动组(HLP+EE+80PTE)的大鼠，肝脏中nNrf2蛋白的表达量显著提高，Keap1蛋白的表达量则显著降低(P<0.05)。这表明紫檀芪与耐力运动能有效激活Nrf2/Keap1信号通路，对高脂血症状态下肝脏造成的氧化应激伤害具有一定的防护作用。

当紫檀芪最高剂量与耐力运动联合应用于HLP大鼠时，其对Nrf2/Keap1通路的激活效果比单独耐力运动组(HLP+EE)或单一剂量紫檀芪处理组(HLP+PTE)更为显著(P<0.05)，进一步证实了紫檀芪与耐力运动联合干预的协同效应，对老年高脂血症大鼠肝脏具有显著的保护和改善作用。

通过这些结果，我们可以看出紫檀芪联合耐力运动对老年高脂血症大鼠的肝脏保护作用，主要是通过激活Nrf2/Keap1信号通路来实现的，这为高脂血症的治疗提供了新的思路和方法。

2、讨论

本研究探讨了紫檀芪(pterostilbene,PTE)联合耐力运动对老年高脂血症(HLP)大鼠脂代谢及肝脏保护作用的协同效应。紫檀芪，作为白藜芦醇的一个天然甲氧基化类似物，存在于蓝莓和其他浆果中，已被证实具有显著的生物活性，包括抗氧化、抗炎和改善脂代谢等(Kim et al.,2020;Özyalçın and Sanlier,2023)。相较于白藜芦醇，紫檀芪的独特化学结构赋予了它更强的亲脂性和生物利用度，从而提高了其在生物体内的稳定性和效率(Akinwumi et al.,2018;Lange and Li,2018)。

图5紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏Nrf2/Keap1通路的影响

耐力运动作为一种有效的生活方式干预措施，已被证实能够改善脂代谢和降低氧化应激(Gielen et al.,2010;Ratajczak et al.,2019)。我们的研究结果显示，紫檀芪联合耐力运动能显著纠正老年HLP大鼠的血脂代谢失调，并减轻肝脏损伤。这一发现与Shen等(2023)的研究相呼应，他们的报道显示紫檀芪通过激活Nrf2和AMPK/mTOR路径减轻非酒精性脂肪肝病。

在HLP的背景下，氧化应激扮演了一个关键角色，导致肝脏中MDA和ROS的大量生成，进而引发细胞结构和功能的损伤(Takahashi and Mori,2011;Wang et al.,2012)。本研究显示紫檀芪和耐力运动的组合显著激活了老年HLP大鼠肝脏中的Nrf2/Keap1通路，减少了氧化损伤，这一效果可能得益于紫檀芪的强大抗氧化特性以及耐力运动提高机体抗氧化防御能力的作用。

此外，本研究结果还揭示了紫檀芪联合耐力运动对老年HLP大鼠肝脏脂代谢基因表达的调节作用。通过抑制SREBP1c、ACC-1和FAS等促进脂质生成的关键基因，以及FATP5和CD36等脂肪酸摄取基因，紫檀芪和耐力运动协同改善了脂代谢紊乱，这与紫檀芪对Sirt1和AMPK路径的调节作用相一致(Zhang et al.,2024)。

综上所述，紫檀芪和耐力运动的协同作用不仅改善了老年HLP大鼠的脂代谢状态，而且增强了肝脏的抗氧化能力，减轻了氧化应激引起的细胞损伤。这些发现为高脂血症的综合治疗提供了新的视角和实验依据，强调了天然植物化合物和生活方式干预相结合的重要性。未来的研究应进一步探索这种协同作用的分子机制，以及在人类中的应用潜力。

3、材料与方法

3.1蓝莓中提取紫檀芪的制备方法

新鲜成熟的蓝莓经清洗后被研磨破碎，以增加提取效率。采用乙醇通过室温浸提或低温超声提取法提取紫檀芪等有机化合物，并通过细孔滤纸滤除固体材料。浓缩提取液后，使用硅胶柱层析和梯度洗脱法分离不同成分，通过薄层层析监测并收集含紫檀芪的洗脱液。为进一步提高纯度，高效液相色谱技术被用于纯化，选择合适的固定相和流动相以优化分离。最终，通过高性能液相色谱-质谱联用或核磁共振技术检测紫檀芪的纯度，确保达到98%。干燥后的紫檀芪在干燥、避光、低温条件下储存。

3.2实验动物的选取与高脂血症(HLP)模型的构建

在本研究中，我们选用了18个月龄的SPF级别老年雄性SD大鼠(体重范围400～500 g)，这些大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供(许可证号:SCXK (粤) 2023-0068)。所有动物均在控温(23±2)℃和控湿(55±5)%的环境中饲养，并且遵循12 h的光照/暗周期。

为了建立高脂血症模型，老年大鼠被喂养特制的高脂高胆固醇饮食，持续8周时间。经过这段时间的饲养后，通过测量并筛选脂代谢指标异常的大鼠，确定作为高脂血症(HLP)模型大鼠进行后续实验研究。

3.3实验动物的分组及干预措施

实验共纳入72只大鼠，按随机分配法分为7个组，每组12只：正常对照组(NC组)、高脂血症模型组(HLP组)、高脂血症加耐力运动组(HLP+EE组)、高脂血症加低剂量紫檀芪处理组(HLP+20PTE组)、高脂血症加中剂量紫檀芪处理组(HLP+40PTE组)、高脂血症加高剂量紫檀芪处理组(HLP+80PTE组)及高脂血症加耐力运动和高剂量紫檀芪联合处理组(HLP+EE+80PTE组)。NC组的大鼠采用常规饲料喂养，而其他所有组的大鼠则建立高脂血症模型。在整个实验期间，NC组和HLP组大鼠通过灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，保持静止不动；HLP+EE组通过灌胃给予相同的溶剂，并接受耐力运动训练；HLP+20PTE组、HLP+40PTE组、HLP+80PTE组分别通过灌胃给予20、40、80 mg/kg/日的紫檀芪，并保持不动；HLP+EE+80PTE组则是在给予80 mg/kg/日紫檀芪的同时，进行耐力运动训练。所有给药后2 h开始进行耐力运动，连续8周。

耐力运动方案设计如下：采用Exer 3/6跑步机(美国Columbus Instruments公司生产)进行，持续时间为8周，每周5次。运动开始时坡度设置为0°。第1周，大鼠的跑步时长分别为20、20、20、25、30 min，速度从20 m/min逐渐增加至30 m/min。第2至第4周，每次跑步时长固定为40 min，起始速度为30 m/min，每10 min速度提升至40 m/min，持续20 s。从第5周到第8周，跑步时长增至每次60 min，起始速度维持30 m/min，每10 min增速至40 m/min，持续40 s。

3.4血液样本的采集与处理

为了进行血清脂代谢指标的检测，首先需要对实验大鼠进行过夜禁食。随后，通过眼眶后静脉丛采集血液样本。采集后，样本立即在4℃条件下离心(3 000 r/min,持续10 min)，以制备血清。这一步骤是为了确保后续血清脂代谢指标分析的准确性。

3.5肝组织样本的收集与保存

在完成血液采集后，实验大鼠将被安乐死，以取出肝脏样本。取出的肝脏首先用冷生理盐水清洗，随后分为两个部分处理。一部分将在4℃条件下保存，为后续的组织学研究做准备，并在4%多聚甲醛溶液中固定72 h。另一部分则迅速在液氮中冷冻，随后转移到-80℃保存，用于进一步的氧化应激指标分析、实时定量PCR (RT-qPCR)以及蛋白质印迹(Western blotting)实验。

3.6血清脂代谢指标的测定

利用AU2700全自动生化分析仪(由日本Olympus公司提供)来测量血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的水平。这些指标是评估脂质代谢状态的重要指标。

3.7肝脏组织的HE染色

对固定的肝脏组织切片(厚度为4μm)进行苏木精-伊红(HE)染色，以观察其形态结构。染色过程严格遵循试剂盒提供的说明。染色完成后，样本将在显微镜下进行观察，以评估肝脏的形态变化。

3.8肝脏氧化应激指标的检测

将肝组织样本剪碎并研磨成匀浆，之后在4℃条件下离心(12 000 r/min,持续15 min)，以制备上清液。利用上清液，根据试剂盒的说明，测定肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)的水平，这些指标反映了肝脏的氧化应激状态。

3.9 RT-q PCR分析

本实验采用Trizol试剂(按照制造商说明)，从50 mg肝脏样本中提取总RNA。随后，使用反转录试剂盒(RR036A,TaKaRa,Japan)将提取的总RNA逆转录成cDNA。定量PCR分析采用SYBRⓇPreMix Ex TaqTMII试剂盒(RR820A,TaKaRa,Japan)，在20μL的反应体系中进行。PCR的循环条件设置为：初步变性95℃预热3 min，随后95℃变性40 s,62℃退火30 s,72℃延伸30 s，共40个循环。实验结束后，以β-actin作为内参基因，通过CT值和溶出曲线分析法计算基因的相对表达水平，采用2-ΔΔCt方法进行量化。引物序已列出(表1)。

表1引物序列

3.1 0 Western blotting

使用含蛋白酶抑制剂的裂解液提取样品中的蛋白，并通过BCA蛋白分析试剂盒确定蛋白浓度。蛋白样品经变性处理后，使用10%SDS-PAGE进行电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜。膜在含5%牛血清白蛋白的溶液中孵育2 h，随后与针对Nrf2、Keap1、Histone H3和β-actin的一抗在4℃下孵育过夜。之后，膜在室温下与二抗孵育2 h，最后通过ECL发光液显色。使用Histone H3和β-actin作为核蛋白和总蛋白的内参标准，利用Image J软件对条带进行灰度值分析。

3.11统计分析

实验结果表示为12只大鼠每组的平均值±标准差。组间差异通过单因素方差分析和Tukey事后测试进行评估，设定显著性水平为P<0.05。具体标记为a：与NC组比较，P<0.05;b：与HLP组比较，P<0.05;c：与HLP+EE组比较，P<0.05;d：与HLP+80PTE组比较，P<0.05。所有统计分析均使用SPSS 21.0软件完成。

作者贡献

柳志雄是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析；柳志雄和邓晶共同完成论文初稿的写作与修改。两位作者本人阅读并同意最终的文本。

文章来源:柳志雄,邓晶.蓝莓提取物紫檀芪与耐力运动联合对老年高脂血症大鼠脂代谢的影响[J].分子植物育种,2024,22(17):5834-5841.