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不同程度大鼠颅脑损伤股骨骨折骨愈合比较

2024-11-21 1 上传者：管理员

摘要：[目的]探究大鼠不同程度创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury, TBI）合并单侧股骨骨折愈合的影响，以及降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）及骨保护素（osteoprotegerin, OPG）/核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL）在其中的作用。[方法] 80只雄性11周龄大鼠随机分为4组，每组20只，按照神经功能缺损评分（neurological severity score, NSS）标准建立模型，分为单纯股骨骨折（无损伤组）、轻度TBI合并股骨骨折（轻度组）、中度TBI合并股骨骨折（中度组）、重度TBI合并股骨骨折（重度组）。比较骨折愈合情况及血清检测结果。[结果]无损伤组、轻度组、中度组和重度组术后6周骨折愈合X线评分为[（1.0±0.7） vs （1.0±0.7） vs （1.8±0.5） vs （1.8±0.5）, P<0.001]，骨痂体积为[（418.6±25.7） mm3vs （414.3±29.6） mm3vs （689.8±31.2） mm3vs （681.4±31.8） mm3, P<0.001]，其中度组和重度组显著高于无损伤组和轻度组。血清检测方面，无损伤组、轻度组、中度组和重度组术后6周的CGRP [（10.9±0.9） pg/ml vs （11.1±0.7） pg/ml vs（15.2±0.6） pg/ml vs （15.6±0.5） pg/ml, P<0.001]、OPG [（1 131.6±49.9） pg/ml vs （1 180.6±49.3） pg/ml vs （1 443.8±42.3） pg/ml vs （1 457.6±43.8） pg/ml, P<0.001]、RANKL [（66.1±6.8） pg/ml vs （68.3±5.4） pg/ml vs （49.5±5.8） pg/ml vs （50.2±6.0） pg/ml, P<0.001]、OPG/RANKL[（17.2±1.1） vs （17.3±0.7） vs （29.4±2.7） vs （29.3±2.6）, P<0.001]，上述指标，中度组和重度组与无损伤组和轻度组之间差异均有统计学意义。[结论]中、重度组可以有效促进骨折端骨痂生长，缩短骨折愈合时间，这可能与血清中CGRP浓度与OPG/RANKL表达比值升高有关。

关键词：
创伤性颅脑损伤
核因子κB受体活化因子配体(RANKL)
降钙素基因相关肽(CGRP)
骨保护素(OPG)
骨折愈合
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创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）合并四肢骨折是常见的严重多发伤之一，目前TBI后骨折部位骨痂过度生长、骨折愈合加快现象在临床中已被广泛认知[1]。1968年Robert首次报道TBI和长期昏迷患者伴有骨折部位大量骨痂形成；而后有研究证实，合并TBI能够加速长骨骨折愈合的现象[2,3]。有研究发现，TBI时血脑屏障渗透性增加，同时与骨折愈合相关的神经因子表达会明显升高，这些升高的神经因子可以通过损伤的血脑屏障渗透到体液循环中，并通过体液循环运送到损伤部位，从而导致异位骨化、促进骨折愈合[4]。另外，支配骨组织的神经中富含多种神经肽和激素，能够促进骨骼的形成、发育和修复[5]。其中以降钙素基因相关肽受体（calcitonin gene-related peptide receptors,CGRP）表达为核心的临床研究是当前创伤性颅脑损伤后促进骨折愈合机制的研究热点之一。CGRP是一种在感觉神经元中含量丰富的神经肽，且可以通过上调成骨细胞活性并下调破骨细胞活性，促进骨组织修复重建[6]。Zhang等[7]研究发现，与单纯骨折相比，TBI合并骨折时机体CGRP的表达会升高。Xu等[8]报道TBI诱导的CGRP在脑组织中可以通过自分泌或旁分泌等方式保护损伤的脑组织，并且在TBI后，脑脊液及血清中的神经生长因子和CGRP能够促进骨折愈合。骨折缺氧炎症反应微环境中CGRP过表达是加速骨折愈合的关键，其可能与骨保护素（osteoprotegerin,OPG）/NF-κB受体激活剂配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）通路相关。但是目前关于不同程度TBI对CGRP分泌量、OPG/RANKL系统表达变化以及对骨折愈合过程的影响，相关研究较少。因此，本研究通过分析大鼠不同程度TBI合并股骨骨折模型中CGRP、OPG/RANKL系统的表达变化，探讨不同程度TBI对骨折愈合的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物与主要试剂

雄性Sprague-Dawley (SD）大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号SCXK（鲁）20220006];10%福尔马林中性固定液购自南昌雨露实验器材；苏木素-伊红染色液购自无锡市江源实业公司；EDTA脱钙液购自Solarbio公司；CGRP ELISA试剂盒、OPG ELISA试剂盒、RANKL ELISA试剂盒购自武汉华美生物。

1.2动物分组

80只11周龄雄性大鼠，体重（275±25) g，饲养温度26℃，湿度50%，随机分为4组，每组20只大鼠，根据颅脑损伤程度建造不同程度TBI模型，无损伤组：单纯股骨骨折；轻度组：轻度TBI合并股骨骨折；中度组：中度TBI合并股骨骨折；重度组：重度TBI合并股骨骨折。模型制作后3、6周两个时间点处死动物取材，每组10只。该研究已通过济宁医学院附属医院科学研究伦理委员会批准，编号：2021B115。

1.3颅脑损伤模型的建立

不同程度TBI模型建造参考Foda等[9]设计的冲击加速度系统。大鼠术前4 h禁食，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）全麻，俯卧位，头皮正中切口，将直径1 cm的圆形丙烯酸树脂固定在大鼠颅骨穹窿的中央，大鼠头部置于有机玻璃管正下方。分别选用50、150、250 g砝码，距大鼠头部1 m高度自由落下，砝码撞击头部后消毒缝合，术后6 h运用NSS评分评估颅脑损伤的典型神经学表现。神经功能评分0～18分（正常评分0分；轻度损伤评分1～6分；中度损伤评分7～12分；重度损伤评分13～18分）。

1.4股骨骨折模型建立

取大腿外侧纵向切口，显露股骨，于股骨中段剪断，经左侧髌骨旁切口进入关节囊，将直径1.2 mm的克氏针置入髓腔，进行股骨复位固定，消毒缝合。术后6 h自由饮食，术后连续3 d肌肉注射克林霉素（20 mg/kg）抗炎、盐酸曲马多（1 mg/kg）镇痛。

1.5取材与检测方法

1.5.1 X线检测与评分

实验动物分别于术后3、6周拍摄术侧股骨X线片，观察各组骨折线及骨痂生长情况，采用Goldberg等[10]的方法对骨折愈合进行评分：影像学未愈合为0分；部分愈合为1分；完全愈合为2分。

1.5.2骨痂测量

取大鼠左侧股骨，游标卡尺测量，r1为股骨的直径，r2为骨痂的直径，L为骨痂的长度，采用公式V=2πr1 (r2-r1) L估算骨痂体积[11]。

1.5.3组织学染色

大鼠股骨置于10%福尔马林中性固定剂中固定，16 h后p H 7.2 EDTA脱钙液中脱钙8 h，石蜡包埋，组织切片后置于二甲苯I、II、III溶液中各浸泡5 min脱蜡；浓度梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）脱水；苏木素5 min;1%盐酸酒精分化10 s，随后进行蒸馏水缓慢冲洗2 min；伊红复染3 min；依次置入不同浓度乙醇（浓度梯度75%、85%、95%、100%）各1 min；二甲苯I、II各5 min；中性树胶封片，显微镜观察。

1.5.4血清检测

大鼠全麻，取心脏血约2 ml。4°C,1 000 g离心15 min，取上清，用ELISA免疫试剂盒进行检测：取96孔板分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl，混匀，覆上板贴，37℃放置120 min；弃液，甩干；每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆板贴，37℃，60 min；弃液，甩干，洗板；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆板贴，37℃，60 min；弃液，甩干，洗板；依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色20 min；依序每孔加终止溶液50μl，终止反应；5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。分别检测CGRP、OPG和RANKL，计算OPG/RANKL比值。

1.6统计学方法

采用SPSS 28.0软件和Graph Pad Prism 8.0软件进行数据统计学分析，计量数据以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1颅脑损伤HE表现

大鼠颅脑损伤3 d后顶叶区脑组织HE染色结果显示：无损伤组中神经元分布规则，结构完整。轻度组可见点状轻度水肿，神经元分布较为规整；中度组可见片状水肿，神经元分布较为紊乱；重度组可见大片水肿，神经元分布紊乱，正态分布的神经元较少。

2.2 X线片结果

术后第3周，X线片示无损伤组和轻度组骨痂生成较少，部分愈合，仍可见部分骨折线。中、重度组骨痂明显增多，骨折线已模糊，骨折基本愈合；术后第6周，轻度组和无损伤组仍是部分愈合，骨折线模糊。中、重度组骨折线已消失，骨折已愈合。骨折愈合X线评分见表1，术后3、6周，中、重度组骨折愈合评分显著高于无损伤组和轻度组（P<0.05），而轻度组与无损伤组相比骨折愈合评分的差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3术后骨痂体积

骨痂体积测量结果见表1。与术后3周相比，术后6周4组骨痂生成量均显著增加（P<0.05），术后第3、6周，中、重度组骨痂生成量显著高于无损伤组和轻度组（P<0.05）；而无损伤组与轻度组骨痂生成量的差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4术后骨痂HE表现

骨折术后3周，骨痂经HE染色结果示：无损伤组和轻度组骨痂含量较中、重度组少，肥大的软骨细胞增多，骨小梁不规则，可见局部愈合缺损（图1a～1d）；中、重度组新生骨痂多，有较多形状规则的骨小梁，少量编织骨生成。骨折术后第6周，相比较无损伤组和轻度组，中、重度组成熟骨小梁数量增多，可见较多编织骨和板层骨形成（图1e～1h）。

2.5血清检测结果

血清检测结果见表1，与术后3周相比，术后6周，4组大鼠血清CGRP、OPG、RANKL、OPG/RANKL的比值均无显著变化（P>0.05），术后第3、6周，中、重度组大鼠血清中CGRP和OPG的浓度及OPG/RANKL的比值显著高于无损伤组和轻度组（P<0.05），而RANKL的浓度显著低于无损伤组和轻度组（P<0.05）；中度组与重度组血清中CGRP、OPG及RANKL的浓度的差异均无统计学意义（P>0.05）。

3、讨论

TBI是指由外力作用引起的创伤性结构损伤或脑功能障碍，其合并肢体骨折是神经外科和骨科的常见多发伤[12]。研究表明，相比较单纯骨折患者，骨折合并颅脑损伤后的骨痂生长速度更快、骨折愈合率更高[13]。

CGRP是Rosenfeld于1983年通过DNA重组和分子生物学技术发现的几种具有生物活性的神经肽之一。CGRP由降钙素基因编码，包含5个片段的插入序列和6个片段的外显子，在不同的组织中进行重组可以呈现出不同的产物[14],CGRP是神经系统影响骨组织新陈代谢的重要桥梁递质，其广泛分布于骨骼的感觉神经元中，能够调节骨骼重建的完整性[15]。当支配骨骼的感觉神经元在传导热、机械疼痛以及化学刺激信号时，周围神经末梢可以分泌多种神经递质，而CGRP是周围神经含量最多的一种神经肽，其在骨修复及重建过程中具有重要作用[16]。Song等[17]报道，TBI合并骨折后的骨折愈合时间和矿化早于单纯骨折组，并且证明在颅脑损伤后CGRP可以通过受损的血脑屏障进入血液，协同周围神经分泌的CGRP一起加速骨折愈合。

图1.4组大鼠术后3、6周骨痂组织学表现（HE染色，×40）。

本研究发现创伤术后第3周，中、重度组大鼠血清中CGRP的浓度显著高于无损伤组（P<0.05）。而轻度组与无损伤组血清中CGRP的浓度相比差异无统计学意义（P>0.05）。这表明CGRP作为神经系统分泌的一种神经肽，当受到中、重度TBI后其表达量增加，起到保护大脑的作用。同时TBI后血脑屏障的完整性遭到破坏，脑脊液中的CGRP可能通过血脑屏障进入体液循环，进而导致血清中CGRP含量升高。同时作者认为轻度TBI时难以诱导大脑神经系统内CGRP的表达。

骨形成和骨吸收通常处于动态平衡状态，此过程亦被称为骨转换[18]。OPG/RANKL系统在骨重建与骨折修复过程中起重要作用，它们能够调节破骨细胞的活性，在成骨细胞和破骨细胞之间的转换之间发挥关键作用[19]。OPG是一种在成骨细胞/基质细胞中自然表达的具有潜在破骨细胞生成抑制活性的蛋白质。RANKL由成骨细胞/基质细胞产生，是一种能与RANK结合的跨膜配体。RANK与RANKL相互作用可启动基因表达和信号级联反应，导致破骨细胞前体细胞分化为成熟破骨细胞。OPG作为诱饵受体与RANK竞争性结合，阻止RANK与RANKL结合，进而抑制破骨细胞分化[20]。研究表明，CGRP可以抑制RANKL诱导的破骨细胞前体细胞中NF-κB的激活，显著抑制RANKL介导的破骨细胞生成，从而抑制骨吸收[21]。Wang等利用体外实验证实，CGRP诱导BMSCs向成熟的成骨细胞分化，并抑制RANKL诱导的BMMs激活NF-κB，从而抑制破骨细胞分化和骨吸收[11]。另外，RANKL和OPG是直接调节破骨细胞分化和骨吸收的配体-受体系统的成员，各种神经肽类物质、激素、生长因子和细胞因子等都可以通过对骨细胞和OPG/RANKL系统的直接作用调节骨代谢[22]。

表1.4组大鼠检测结果比较

本研究发现，中、重度组大鼠血清中OPG/RANKL的比值较无损伤组明显增高，而轻度组与无损伤组血清中OPG和RANKL的表达变化差异无统计学意义（P>0.05），在第3、6周，中、重度组生成的骨痂体积比无损伤组和轻度组生成的骨痂体积明显增多，其骨折愈合时间较快，HE染色中骨小梁和编织骨较无损伤组和轻度组和数量要多且较为规整。因此笔者认为中、重度TBI可以促进骨折愈合，其机制可能与颅脑损伤后大鼠血清中CGRP及OPG/RANKL系统的动态变化有关，血清中CGRP的增多调控OPG/RANKL浓度比值升高，进而抑制破骨细胞的增殖分化，促进骨痂的形成，加速骨折愈合进程。

综上所述，本研究发现，轻度TBI可能无法有效诱导大脑神经系统中CGRP的合成，对骨折愈合过程影响较小；然而中、重度TBI后血清中CGRP浓度显著提高，且骨折端骨痂体积明显增大，骨折愈合时间缩短，其机制可能与血脑屏障受损、OPG/RANKL系统表达变化相关。

参考文献:

[5]李世伟,唐学阳,刘利君.脑外伤促进骨折局部骨痂快速形成机制的研究进展[J].中国矫形外科杂志, 2016, 24(22):2069-2073.

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[22]王键,魏劲松,龚颜,等.鲑鱼降钙素对去卵巢大鼠骨髓细胞OPG､RANKL基因和蛋白表达的影响[J].中国矫形外科杂志,2013, 21(7):701-707.

基金资助:济宁医学院贺林院士基金项目(编号:JYHL2018FMS13);济宁医学院高层次科研项目培育计划项目(编号:JYGC2021FKJ016);济宁市重点研发计划基金项目(编号:2021YXNS029､2022YXNS129);

文章来源:卜宪敏,池玉磊,徐英杰,等.不同程度大鼠颅脑损伤股骨骨折骨愈合比较[J].中国矫形外科杂志,2024,32(22):2077-2082.