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头颈部鳞状细胞癌中ITGA5 mRNA的表达及其预后相关性研究

2020-07-11 615 上传者：管理员

摘要：目的：分析头颈部鳞状细胞癌中整合素α5(integrinα5,ITGA5)的表达与预后的相关性。方法：利用TCGA数据库中头颈部鳞状细胞癌的RNA表达数据集和相应的临床随访信息，提取mRNA表达谱进行差异分析，并在GEO数据库中进一步验证。结果：通过TCGA表达谱数据分析发现ITGA5 mRNA在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且Kaplan-Meier分析显示ITGA5高表达组的患者总体存活时间明显缩短(P <0.05)。在GEO数据库中验证后证实ITGA5 mRNA表达水平是1个独立的预后指标，对预测患者生存具有较好的敏感性和特异性。结论：ITGA5与头颈部鳞状细胞癌患者的生存预后密切相关，可能作为新的预后标志物。

关键词：
头颈肿瘤
头颈部鳞状细胞癌
整合素α5
癌症基因组图谱
预后标志物
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头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是世界上第6大常见的恶性肿瘤，是引起死亡的主要癌症类型之一[1]。吸烟、饮酒、咀嚼槟榔和人乳头瘤病毒感染等被认为是导致HNSCC发生的重要原因。目前HNSCC综合序列治疗包括手术切除、放疗和化疗，然而患者5年生存率并没有明显提高[2]。肿瘤临床分期、浸润深度、手术切缘和累及颈部淋巴结等临床病理参数已被确定与肿瘤局部复发、远处转移以及患者生存密切相关[3]。然而，上述预测参数的有效性和特异性相对较低，并不能满足临床需要[3,4]。所以，寻找准确、可靠的生物标志物对HNSCC患者的早期发现、优化分层、治疗方案选择以及预后预测尤为重要。

整合素是一种存在于细胞表面的细胞黏附分子，是由1个α亚基和1个β亚基组成的异二聚体。目前已发现的24种整合素由18种α亚基和8种β亚基以不同的形式组合而成。作为一种跨膜蛋白，整合素在不同的细胞或细胞与细胞外基质之间的通讯中起到纽带作用从而调节细胞增殖和迁移[5]。研究证实整合素参与了多种恶性肿瘤的生长、侵袭和转移[6]。整合素α5(integrinα5,ITGA5）是整合素蛋白家族的一员，与整合素结合β1的亚基形成α5β1异质二聚体，识别其特定的配体纤维连接蛋白[7]。研究证实ITGA5在胃癌、乳腺癌、卵巢癌中呈现高表达，可作为肿瘤预后标志物，且与患者的不良预后密切相关[8,9,10]。但是ITGA5在HNSCC患者中的表达和对预后的影响尚不清楚。

本研究通过公开的在线数据库癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA），对HNSCC患者中ITGA5的表达与预后的相关性进行全面综合的分析，并从GEO(Gene Expression Omnibus）数据库中选择相关数据进行验证，为进一步研究ITGA5在HNSCC发生发展的作用机制、诊断及预后提供了新的线索和思路。

1、材料和方法

1.1材料

公共的在线数据库TCGA包含30多种癌症数千个肿瘤样本的多种模式的基因组数据。利用TCGA数据库的GDC下载软件下载HNSCC的RNA表达（RNA-seq）数据集和相应的临床随访信息，共546例样本数据，包括502例肿瘤组织样本，44例正常组织样本，其中499例患者有完整的随访时间数据。其流行病学、临床病理和随访信息包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤大小、病理分级、颈淋巴结转移及临床分期（表1）。

1.2方法

从RNA-seq数据集中提取出共20 024个mRNA的表达谱。通过R语言软件的Limma R package在样本内部和样本之间进行数据的标准化和归一化，最终定义每个mRNA的表达水平为原始表达值的log2(x+1）。考虑到一些mRNA表达水平相对较低，在RNA测序过程中，丰度可能没有被描述出来。因此，这里定义1个mRNA的丰度筛选条件：≥25%的样本mRNA表达水平大于0。利用R语言软件edgeR R package进行差异分析。此外，从另一个公共的在线数据库GEO下载了2个口腔鳞状细胞癌的独立数据集GSE41613(97例样本）和GSE42743(74例样本）做进一步的提取和联合分析[11]。

表1 TCGA数据库中HNSCC患者的临床病理特征

1.3统计学方法

采用SPSS 22.0和R 3.5.3软件进行统计分析和生成数据图像。肿瘤组织与正常组织间mRNA表达差异采用配对t检验。采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素预后分析。绘制受试者工作特征（ROC）曲线计算曲线下面积（AUC）大小。基于ROC曲线、患者的生存状态和随访时间计算得出的最佳分界值（cutoff value），将患者分成低表达和高表达两组，并绘制Kaplan-Meier曲线，通过logrank test进行检验分析。计算95%置信区间（CI）的风险比（hazard rate,HR）用来评估相关性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1确定ITGA5为研究分析的目的基因

TCGA数据库下载的546例HNSCC 20 024个m RNA表达数据，通过R语言软件的Limma R package进行数据的标准化处理后的表达水平见图1A。通过R语言软件的edgeR R package对mRNA表达谱进行肿瘤组织和正常组织之间的差异分析，得到4 536个表达水平有明显差异的mRNA(P<0.05，图1B），相对于正常组织，其中2 352个mRNA在肿瘤组织中表达水平上调，2 184个mRNA表达水平下调。选取表达水平上调的2 352个mRNA进行单因素Cox回归预后分析，发现191个mRNA的高表达不利于HNSCC患者的生存预后（HR>1,P<0.05）。接下来，在2个口腔鳞状细胞癌的独立数据集GSE41613和GSE42743对这191个mRNA做进一步的提取和单因素Cox回归预后分析后取交集（HR>1,P<0.05，图1C）。有36个mRNA在两个数据集中均为高表达，不利于患者的生存预后。ITGA5在其他类型癌症中已有了相关研究，而在HNSCC中尚未见研究报道。对TCGA的HNSCC数据分析显示：ITGA5在肿瘤组织与正常组织之间的差异较明显[log2(Fold change)=2.342,P<0.001）]。因此，选择ITGA5作为研究对象进行后续分析。

图1筛选TCGA和GEO数据库中差异及与预后相关的基因

2.2 ITGA5 mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达差异

TCGA的HNSCC数据库中，ITGA5 mRNA在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.001，图2A）。对数据库中44例HNSCC肿瘤组织与其配对的正常组织中的ITGA5 mRNA表达水平进行配对t检验，显示相对于正常组织，肿瘤组织中ITGA5呈现出显著高表达（图2B），且差异具有统计学意义（P<0.001）。使用了GEPIA对TCGA收录的33种癌症数据进行分析，发现ITGA5不是特异性地在HNSCC患者中呈现高表达（图2C）。ITGA5在多形成性胶质细胞瘤（GBM）、肾透明细胞癌（KIRC）、胰腺癌（PAAD）、睾丸癌（TGCT）和HNSCC这5种癌症的肿瘤组织中显著高表达。在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、结肠癌（COAD）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma,DLBC）等14种癌症的肿瘤组织中呈显著低表达（P<0.05），进一步说明了ITGA5与癌症的密切关系。

2.3 ITGA5 mRNA表达与HNSCC患者生存预后的关系

本研究中下载的TCGA数据中，499例患者有完整的临床随访信息，利用R语言软件的ROC package绘制ROC曲线图来评价ITGA5 mRNA表达水平预测患者生存预后的敏感性和特异性。ROC曲线下面积AUC为0.615（图3A）。根据ROC曲线计算在最大敏感性和特异性下得出的ITGA5 mRNA表达水平的最佳分界值（23.435），将患者划分为低表达组（n=263）和高表达组（n=236），用于患者的总体生存率分析。经Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验表明，相对于低表达组患者，ITGA5 mRNA高表达组患者总体生存率明显降低（图3B,P<0.001）。

2.4 HNSCC中ITGA5 mRNA表达水平和临床病理参数的单因素和多因素预后分析

接下来对ITGA5 mRNA表达水平和一些临床病理参数进行Cox回归分析。单因素Cox回归分析表明ITGA5 mRNA表达水平与患者的总体生存率显著相关（HR=1.572,95%CI=1.200～2.060,P=0.001，表2）。此外，几个目前临床上已经确认的预后因素，如肿瘤大小、病理分期、颈部淋巴结转移在该数据库中也表现为与患者的总体生存率相关。为了进一步表现ITGA5 mRNA表达水平的预后价值，去除了其他混杂因素后进行多因素Cox回归分析，结果表明ITGA5 mRNA表达水平是1个独立的预后指标（HR=1.396,95%CI=1.017～1.916,P=0.039，表2）。

图2 TCGA数据库中ITGA5 mRNA在HNSCC组织与配对正常组织样本之间的表达差异

图3 TCGA数据库中ITGA5 mRNA表达与HNSCC患者总体生存率的关系

2.5在GEO数据库中验证ITGA5的预后意义

Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验显示在GSE41613和GSE42743中，相对于ITGA5 mRNA低表达组的患者，高表达组的患者总体生存率也显著降低（P<0.001,P=0.020，图4A、B）。两组GEO数据ROC曲线的AUC分别为0.718和0.644（图4C、D），表明ITGA5 mRNA表达水平对预测患者生存具有较好的敏感性和特异性。

3、讨论

HNSCC是由基因变异、表观遗传以及环境等因素引起的鳞状细胞癌[12]。HNSCC患者的预后不佳，寻找有效预测能力的生物标志物和药物治疗靶标为当下的迫切需求。随着微阵列和RNA测序等高通量技术的巨大进步，基因图谱已经成为了解癌症进展、治疗选择和寻找预测患者结局的分子生物标志物的有力手段[13]。通过对口腔鳞癌数据库进行提取和分析，发现了36个mRNA高表达不利于患者的生存预后，由于ITGA5在HNSCC中尚未有研究报道，且其在肿瘤组织与正常组织之间的差异较明显[log2(Fold change)=2.342,P<0.001]，因此，选取ITGA5作为研究对象。本研究从TCGA数据库中挖掘了HNSCC患者原始的RNA-seq数据，从而确认ITGA5独立于传统的预后因素而与患者的生存密切相关，并进一步在GEO数据库的原始数据中进行了验证。

最近研究结果表明，整合素参与干细胞和癌症生物学的调控，是癌症发展和肿瘤细胞耐药所必需的。整合素通过依赖黏附和非黏附途径促进癌症进展，特异性的整合素不仅是干细胞标志物，同时决定干细胞的行为，并且整合素通过典型和非典型机制调控治疗的耐药性[14]。其中以ITGA5的异常表达与癌症的发生发展更为密切相关。ITGA5基因是整合素家族的重要一员，位于染色体上12q11～q13，编码纤维连接受体蛋白ITGA5，具有组织和功能特异性，其主要是通过细胞外结构与细胞外基质蛋白结合，调节细胞黏附、增殖、凋亡和运动等生物学功能[15,16]。ITGA5在胃癌中呈现高表达，且ITGA5高表达的患者生存预后更差[8]。ITGA5糖基化修饰还会促进结直肠癌的发生和发展[17]。ITGA5还可作为非小细胞肺癌的独立预后因子[18]。此外，ITGA5在不同癌症中还发挥不同的生物学功能。人类间充质干细胞可通过靶向调控ITGA5促进肝癌细胞的迁移和侵袭[19]。ITGA5在乳腺癌中可促进癌细胞向骨黏附，与乳腺癌的骨转移有关[20]。在胃癌中，靶向抑制ITGA5会导致胃癌细胞的侵袭、迁移能力明显下降[21]。值得注意的是，有研究表明ITGA5通过调控PI3K/AKT信号通路的激活，促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭从而促进口腔鳞状细胞癌的恶性进展[22]。口腔是HNSCC最主要的发病部位[23,24]。虽然ITGA5已被证实是口腔癌的促癌基因之一，但是其在人类HNSCC中的表达情况及与癌症发生、发展及预后的关系尚未被证实。且ITGA5并非在所有肿瘤中呈高表达，在部分肿瘤组织呈显著低表达（图2C）。因此本研究首先利用TCGA数据集进行差异表达、单因素回归分析并结合GEO数据库，最终确认ITGA5在HNSCC患者中明显高表达，说明其在HNSCC中是促癌基因。然后进行生存预后分析，并采用ROC曲线评价其预测能力，发现ITGA5与HNSCC患者的生存预后密切相关。Cox因素回归分析进一步说明了ITGA5是1个独立的预后因素。

表2 ITGA5 mRNA表达水平与临床病理参数的单因素及多因素Cox回归分析

图4在GSE41613和GSE42743中验证ITGA5 mRNA的表达与患者总体生存率的关系

综上所述，本研究采用生物信息学的方法利用TCGA与GEO的肿瘤大样本数据库进行分析，发现ITGA5可能有预测HNSCC的作用，可作为HNSCC发生、发展及预后的生物标志物，为HNSCC提供了潜在的治疗靶点。未来需进一步探索ITGA5在HNSCC中的生物学功能及其作用机制，为临床治疗提供新的手段和思路。

张舒婷,刁鹏飞,金致纯,严斌,王林.基于TCGA数据库分析ITGA5 mRNA在头颈部鳞状细胞癌中的表达及其预后价值[J].南京医科大学学报(自然科学版),2020,40(06):832-838.

基金:国家自然科学基金(81571005);江苏省高等学校自然科学研究重大项目(17KJA320003);江苏省“333高层次人才培养工程”(BRA2016511);江苏省高校优势学科建设工程资助项目