头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤，每年新增确诊人数约84万，是全球第八大恶性肿瘤[1,2]。HNSCC主要由口腔、咽部和喉部的黏膜上皮发展而来，通常与烟草、酒精、人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染和疱疹病毒(epstein-barr virus, EB)感染有关，不良的生活习惯如咀嚼槟榔也是致癌因素之一[3,4]。外科手术是目前治疗HNSCC最常见的手段，术后往往辅以药物治疗和放射治疗[5],这一系列的治疗对患者外貌及口腔功能产生巨大影响，不少患者深受其困扰[6]。尽管如此，HNSCC根治术后的5年生存率仅有32.3%[2]。HPV阳性的HNSCC可以通过接种HPV疫苗进行预防，而口腔和喉部的HNSCC仍然主要与吸烟有关，目前尚无有效的筛查策略[7,8]。为此，我们需要寻找新的标志物，来更好地对HNSCC进行诊断、评估预后以及作为其分子治疗的新靶点。

Sec31A(Sec31 homolog A)是外被体蛋白复合物Ⅱ(component of the coat protein complexⅡ,COPⅡ)的外层衣被组成部分，Sec31A定位在人染色体4q21.22上，编码由1 220个氨基酸构成的蛋白。Sec31A在人体组织中普遍表达，并在垂体、甲状腺、前列腺、膀胱、肺等多种组织中呈高表达[9]。Halperin等[9]发现了Sec31A可以通过增强内质网的应激反应从而降低细胞活力，并引起神经系统疾病。既往研究表明，Sec31A可以与Sec13结合成异质四聚体，并相互作用以促进mTORC1的激活，从而使其不受SKP1依赖的蛋白酶体降解的影响，因此Sec31A的缺失会损害小鼠T细胞的激活和Treg细胞的抑制功能[10]。另外有研究发现circSec31A可以通过充当miR-376a的海绵和调节miR-520a-5p/GOT-2轴的途径影响非小细胞癌的发生发展，敲低circSec31A后抑制了非小细胞癌的恶性进展[11,12];另有学者发现Sec31A在肝癌和胰腺癌中的表达显著上调，且高表达的Sec31A可以促进肝癌细胞的有氧糖酵解过程从而促进癌细胞的增殖[13,14]。然而，Sec31A在HNSCC中的表达及作用并未有研究报道。本文旨在明确Sec31A在HNSCC中的表达情况，通过一系列表型实验验证其对HNSCC细胞生物学行为的影响，并对其机制进行初步探究，为HNSCC的分子靶向治疗提供新的可能性。

1、材料与方法

1.1 细胞与主要试剂耗材

HNSCC细胞株HN6、HN4由上海交通大学第九人民医院赠送，si-Sec31A、si-NC小干扰质粒购于上海吉玛制药技术有限公司，β-actin、Sec31A、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K、p-mTOR、mTOR抗体购于美国Proteintech公司，DMEM/F-12培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于中国Cell Max公司，胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗、蛋白裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购于中国碧云天公司，Lipofectamine2000购于美国Thermo Fisher公司，Trizol、HiscriptⅡ Q RT SuperMixforqPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购于中国Vazyme公司，CCK-8试剂盒购于美国APExBIO公司，PAGE凝胶快速制备试剂盒购于中国雅酶公司，基质胶购于美国Corning公司、8 μm Transwell小室、PVDF膜购于美国Millipore公司。

1.2 生物学信息分析

从TCGA数据库下载520例HNSCC组织和44例癌旁正常组织的转录组测序数据，并用UALCAN(http: //ualcan.path.uab.edu/)对共564例组织进行基因转录数据和临床数据的分析，使用SPSS 26.0版软件进行统计学分析，P<0.05时差异具有统计学意义。

1.3 免疫组化染色实验

该实验由南京医科大学附属口腔医院伦理委员会批准实施(No.PJ2018-051-001)。将2009—2014年南京医科大学附属口腔医院收集的242个原发HNSCC组织和32个口腔正常黏膜组织制成石蜡组织芯片，37 ℃烘箱烤片2 h, 按顺序进行脱蜡、梯度水化、抗原修复、灭活过氧化物酶、封闭、孵育Sec31A一抗(4 ℃过夜);第二天洗净一抗，室温孵育酶标二抗30 min, 使用DAB显色液显色，脱水固定，中性树胶封片，最后置于正置显微镜下观察染色情况。

1.4 细胞培养与转染

HN6和HN4均使用完全培养基(10%胎牛血清+89%DMEM/F-12培养基+1%青霉素/链霉素双抗)培养在37 ℃恒温、5%CO2恒压培养箱中，每天观察细胞状态，当培养液颜色变淡时更换培养液，当细胞长至80%以上时进行细胞传代。选取状态良好的HN6和HN4细胞，均匀接种在6孔板内，每种细胞各3孔，待细胞密度达到60%时，将培养液换成不含血清的基础培养液，分别将si-Sec31A-1、si-Sec31A-2、si-NC按照Lipofectamine2000说明书配成转染液并加入各孔，6～8 h后将原培养液换成完全培养基。转染48 h后提取细胞总蛋白，转染72 h后提取细胞总RNA以备后续实验。将HN6细胞均匀接种在直径6 cm的培养皿中，转染si-Sec31A和si-NC 2 d后向培养液中加入适量嘌呤霉素，使其终浓度为1 mg/L,细胞长至90%时进行传代，2周后进行qRT-PCR检测敲减效率，筛选Sec31A稳定敲减细胞株及对照分别定义为HN6-siSec31A、HN6-siNC。

1.5 qRT-PCR实验

HN6和HN4转染si-Sec31A、si-NC 48 h后，按照Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA;先根据Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix试剂盒说明书操作，将RNA逆转成cDNA;再根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书配制总体系，每孔各20 μL完成上样。使用ABI Q7进行qRT-PCR实验，将GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT对目的基因的表达进行分析。所有引物由安徽通用引物公司设计合成，引物序列如下。GAPDH F:5′-GAGAAGTATGACAACAGCCTCAA-3′,R:5′-GCCATCACGCCACA-GTTT-3′;Sec31A F:5′-AGGCACTGGGCAGGTAAG-3′,R:5′-GTGGCACCTTCCAGGGTC-3′。

1.6 CCK-8实验

HN6、HN4转染48 h后，胰酶消化，离心后重悬，用细胞计数板计数，按照每孔2×103个细胞的密度接种在96孔板中，每组设置5个复孔，待细胞贴壁后，一般为接种后6～8 h进行第0天的检测。在避光条件下，无血清培养液与CCK-8原液按照体积比9∶1的比例配制CCK-8工作液，去除检测孔中的原培养液，PBS洗净后每孔加入100 μL CCK-8工作液，放入37 ℃恒温培养箱中孵育2 h, 使用微孔板分光光度计检测各孔在450 nm波长处的光密度值(OD值)。随后在第1、2、3、4、5、6天的同一时间进行检测。

1.7 平板克隆实验

HN6、HN4转染48 h后，胰酶消化，离心后重悬，用细胞计数板计数，按照每皿2×103个细胞的密度均匀接种在直径6 cm的培养皿中，每3 d更换培养液。显微镜下观察细胞集落大小，待每个集落的细胞数大于50个后终止培养。去除原培养液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min, 结晶紫染色15 min, 洗净染色液，自然晾干后使用扫描仪拍摄，并用Image J软件进行定量分析。

1.8 划痕愈合实验

HN6、HN4转染48 h接种于6孔板中，待板中密度达到90%时，用200 μL黄色枪头垂直于孔底进行划痕，每孔划3条，每条划痕平行等宽。PBS清洗划痕时脱落的细胞，将培养液换成不含血清的基础培养液，于显微镜下拍摄初始划痕。随后每隔6 h观察一次，共观察18 h。使用Image J软件计算每个观察时间点的划痕面积。划痕愈合率=(初始划痕面积-最终划痕面积)/初始划痕面积×100%。

1.9 Transwell实验

将基质胶与基础培养基按照1∶6的比例稀释，向Transwell小室加入50 μL基质胶稀释液，放入37 ℃培养箱中待其凝固。HN6、HN4转染48 h后，胰酶消化，离心后重悬，用细胞计数板计数，按照每孔5×105个细胞的浓度配制无血清细胞悬液，在下室加入800 μL含10%胎牛血清的完全培养液，放入37 ℃培养箱培养。24 h后去除小室上室原培养液，4%多聚甲醛固定30 min, 结晶紫染色15 min, 流水洗净多余结晶紫，用棉棒轻轻擦去小室膜上未穿出的细胞，自然晾干后，显微镜下观察细胞侵袭情况，并随机选取3个视野拍照留存，用Image J软件对细胞数量进行分析。

1.10 Western Blot实验

HN6、HN4转染72 h后，按照蛋白裂解液试剂说明书提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。使用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒制胶，恒压60 V压缩蛋白，恒压120 V分离蛋白，恒流300 mA转膜，5%牛奶封闭2 h, 洗净封闭液后封一抗，置于4 ℃冰箱孵育过夜；第二天TBST洗净一抗，室温下孵育酶标二抗1 h, TBST洗净二抗，使用化学发光显色液显色，用化学发光成像系统检测相关蛋白的表达，并用Image J软件进行量化。

1.11 动物实验

实验经南京医科大学伦理委员会批准实施(伦理号：IACUC-1011015),从江苏集萃药康生物有限公司购买8只4周龄大的BALB/c裸鼠，随机分成实验组和对照组，每组各4只。将转染稳定细胞株HN6-siSec31A和HN6-siNC胰酶消化，离心重悬，细胞计数板计数，取含有1×106个细胞的细胞悬液，与等体积基质胶混合，接种至裸鼠皮下。每4 d观察裸鼠的体重变化及瘤体大小，24 d后处死裸鼠，解剖瘤体并拍照留存，测量瘤体的长径L和短径W(mm),体积公式为V(mm3)=LW2/2。

1.12 统计学分析

运用SPSS 26.0版软件对数据进行统计学分析，运用GraphPad Prism 8.0.1版软件进行绘图，两组数据比较使用t检验，多组数据比较使用单因素方差分析，单因素方差后的两两比较使用SNK-q检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Sec31A在HNSCC组织中表达升高，且与患者预后不良相关

比较TCGA数据库中520例HNSCC组织和44例癌旁正常组织中Sec31A转录组测序数据，结果显示HNSCC组织中Sec31A转录水平显著高于癌旁正常组织(P<0.001)(图1A);使用UALCAN网站进行临床特征差异表达分析，结果显示肿瘤组织中Sec31A转录水平越高，肿瘤分级越高(图1B),生存时间越少(图1C);对242例原发HNSCC组织和32例口腔正常黏膜组织的临床样本进行免疫组化染色，结果显示与正常口腔黏膜组织相比，Sec31A在肿瘤组织中高表达(图1D)。

图1 Sec31A在HNSCC组织中的表达情况

2.2 Sec31A敲低效率验证

针对Sec31A设计了两种siRNA,并用qRT-PCR实验验证敲减效率。结果显示HN4细胞中si-Sec31A-1、si-Sec31A-2组Sec31A表达量分别为si-NC组的(0.46±0.05)倍、(0.66±0.06)倍，HN6各组Sec31A表达量分别为si-NC组的(0.46±0.02)倍、(0.69±0.04)倍。两种siRNA均降低了HN6、HN4细胞中Sec31A的表达(P<0.05),且si-Sec31A-1的敲减效率比si-Sec31A-2更高(图2),因此选取si-Sec31A-1进行后续实验，下文将其称为si-Sec31A。

2.3 HN6、HN4细胞敲低Sec31A后增殖能力下降

CCK-8实验显示，与对照组相比，转染si-Sec31A后，HN4、HN6细胞在450 nm处的OD值明显降低(P<0.001)(图3A);平板克隆实验显示，HN4、HN6细胞敲低Sec31A后，相同时间内形成的细胞集落数目明显少于对照组(P<0.001)(图3B、C)。以上结果显示敲低Sec31A后，HN6、HN4细胞的增殖能力下降。

图2 Sec31A敲减效率验证

图3 Sec31A敲低后对细胞增殖能力的影响   

2.4 HN6、HN4细胞敲低Sec31A后迁移能力下降

划痕愈合实验显示，划痕18 h后HN4细胞转染si-Sec31A、si-NC组划痕愈合率分别为(60.80±0.76)%、(91.50±0.51)%,两组HN6细胞划痕愈合率分别为(52.48±1.04)%、(87.91±1.69)%,与转染si-NC组相比，si-Sec31A组相同时间内划痕愈合率显著减少(P<0.001)(图4),证明敲低Sec31A后HN6、HN4细胞的迁移能力下降。

图4 Sec31A敲低后对细胞迁移能力的影响   

2.5 HN6、HN4细胞敲低Sec31A后侵袭能力下降

Transwell实验显示，HN4细胞转染si-Sec31A、si-NC组穿出小室的细胞个数分别为(193.67±8.74)个、(367.33±4.16)个，两组HN6穿出小室细胞个数分别为(263.05±7.19)个、(433.02±12.53)个，与si-NC组相比，si-Sec31A组相同时间内侵袭的细胞个数明显减少(P<0.001)(图5),证明敲低Sec31后HN6、HN4细胞的侵袭能力下降。

2.6 HN6、HN4细胞敲低Sec31A后抑制PI3K/AKT/mTOR(PAM)通路

Western Blot实验结果显示，HN6、HN4转染si-Sec31A后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达均显著下降(图6),表明敲低Sec31A后在一定程度上抑制了PAM通路。

2.7 敲低Sec31A抑制裸鼠皮下移植瘤的生长

裸鼠皮下成瘤实验发现，注射HN6-siSec31A细胞的实验组形成的肿瘤体积(110.69±66.20)mm3显著小于对照组(264.25±50.84)mm3(P<0.05)(图7A、B),免疫组化染色结果显示实验组移植瘤Sec31A的染色程度明显浅于对照组(图7C)。以上实验证明HN6敲低Sec31A后在体内成瘤的作用减弱。

图5 Sec31A敲低后对细胞侵袭能力的影响  

图6 Sec31A敲低后对细胞中PAM通路相关蛋白的变化

图7 敲低Sec31A抑制体内移植瘤的生长

3、讨论

越来越多的研究表明Sec31A的表达与肿瘤的恶性行为有关，提示其成为新恶性肿瘤分子标志物的可能性。在本研究中， 我们通过分析TCGA库中HNSCC的测序数据，发现Sec31A在HNSCC组织中呈高表达，并与肿瘤分级呈显著正相关，与患者的生存时间呈负相关，提示Sec31A高表达可能与患者预后不良有关；同时对临床上收集的242个原发HNSCC组织和32个正常口腔黏膜组织进行免疫组化染色，验证了Sec31A在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织。随后，我们体外培养HNSCC细胞系HN6和HN4,转染小干扰RNA成功敲低细胞中Sec31A的表达后，通过CCK-8实验和平板克隆实验，发现敲低Sec31A后，HN4和HN6的增殖能力明显下降；通过划痕愈合实验发现与对照组相比，si组细胞的迁移能力显著下降；通过Transwell实验发现si组细胞的侵袭能力也显著小于对照组。以上结果证明Sec31A对HNSCC细胞起到调控作用，敲低Sec31A后，通过抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭从而抑制HNSCC的进展。

Sec13是Sec31A的同源物[15],早在2003年已有研究验证了Sec13是调控mTORC1的关键蛋白[16,17],当mTOR被长期抑制后，其下游效应分子S6k1的活性降低，从而负反馈回路生成，使得PI3K-AKT被激活[18]。众所周知，PI3K/AKT/mTOR(PAM)通路是经典的响应胰岛素信号的通路[19,20],除此以外还参与生长和代谢的调节，其与肿瘤的发生、发展也密切相关[21,22]。激活PAM通路可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，从而促进细胞的生存和增殖，此外该通路同时参与血管的生成，因此PAM的异常激活可导致肿瘤的进展和转移[23,24]。目前，mTOR抑制剂依维莫司和替西罗莫司已获得批准用于肿瘤治疗，但疗效和耐药性还需进一步评估[25,26]。而Sec31A可以与Sec13结合成复合体从而促进mTORC1的激活[10],因此我们猜测，Sec31A有可能通过PAM通路来促进HNSCC的发生和发展。通过WB实验结果显示敲低Sec31A后，HN4和HN6细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均显著下降，因此，我们初步判断出Sec31A可能通过激活PAM通路从而提高HNSCC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

此外，我们还进行了裸鼠皮下移植瘤实验，将HN6细胞转染si-Sec31A后与等体积基质胶混合注射至裸鼠皮下，将移植瘤大体解剖并观察，实验组瘤体的重量和体积明显小于对照组；另外将移植瘤组织进行免疫组化染色，发现对照组中Sec31A的染色强度明显强于实验组。体内实验与细胞实验结果一致，且更直观地反映了Sec31A对HNSCC细胞在体内生长的促进作用。

综上，Sec31A在HNSCC组织中呈高表达，并与患者预后不良有关；敲低Sec31A可以抑制HNSCC细胞的生物学行为，有可能通过PI3K/AKT/mTOR通路对HNSCC细胞进行调控。本研究首次对HNSCC中Sec31A的作用进行探索，但对于机制的研究尚浅，需要进一步寻找下游靶标，为HNSCC的分子靶向治疗的新靶点提供理论依据。

参考文献:

[13]阴艺娜,苏民,林梓航,等.环状RNA-SEC31A对胰腺癌细胞侵袭､迁移的影响及其机制研究[J].中华胰腺病杂志,2023,9(2):99-107.

[14]喻言,钟红珊.环状RNA SEC31A促进肝癌细胞增殖和有氧糖酵解[J].中国医科大学学报,2021,50(4):302-306,311.

[20]董硕,汤春波.PI3K/AKT信号通路在2型糖尿病患者种植体骨结合中作用机制的研究进展[J].口腔医学,2022,42(11):1026-1030,1035.

基金资助:国家自然科学基金(81772887);

文章来源:何垚,赵振远,高腾,等.敲低Sec31A对头颈鳞状细胞癌恶性表型的影响[J].口腔医学,2024,44(07):487-493.