雌激素是骨代谢的关键调节因子[1],可抑制破骨细胞发育，促进成骨分化[2,3]。黄酮类化合物化学成分及结构类似雌激素，在传统中医中被广泛使用[4]。其中槲皮素作为主要的膳食黄酮类化合物，在抗炎[5]、抗癌[6]、神经保护、心脏保护和化学预防[7]等方面发挥重要作用。有研究表明，槲皮素可促进成骨细胞分化[8,9,10,11,12],但如何有效利用并控制槲皮素释放以实现精准给药还有待进一步研究。

明胶属于生物质材料，在体内可被完全降解[13],常作为载药体系[14,15,16,17]。本实验拟制备负载槲皮素的明胶三维多孔(G-quercetin)微球，研究该材料的生物相容性及其对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化的影响，为G-quercetin复合微球有效应用于骨组织工程提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 主要材料和仪器

MC3T3-E1细胞；α-MEM培养液、胰蛋白酶、青霉素/链霉素(Hyclone, 美国);胎牛血清(四季青，中国);BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒、茜素红(碧云天，中国);地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、明胶、槲皮素(Sigma, 美国);FITC-鬼笔环肽、DAPI、SYBR Green RT-PCR试剂盒(元升生物，中国);活死细胞检测试剂盒(翌圣生物，中国);CCK-8试剂盒(Dojido, 日本);RNA反转录试剂盒(Takara, 日本);span-80、液体石蜡、戊二醛、乙腈、异丙醇、甲醇、磷酸、丙酮(国药集团，中国)。

色谱柱(GL Sciences, 日本);激光共聚焦显微镜(Leica, 德国);高效液相色谱仪(Thermo, 美国);酶标仪(德铁，美国);PCR仪(Roche, 美国);倒置显微镜(Nikon, 日本);扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)(飞纳，荷兰)。

1.2 G-quercetin复合微球制备

采用W/O乳化法制备明胶微球。分别配制10 mL 含或不含槲皮素(10 mg/mL)的10%明胶溶液，过滤去除杂质，作为分散相。向液体石蜡中加入1% span-80配制油相乳化剂，以此作为连续相。将分散相加入到连续相中，得到W/O型乳液，乳化30 min后，向乳液中加入10 mL 2.5%戊二醛，交联2 h, 加入NaHCO3除去剩余戊二醛。3 000 r/min离心5 min, 异丙醇、丙酮脱水洗3次，最后冷冻干燥得到明胶微球(Gm)和G-quercetin复合微球。

1.3 载药量和包封率检测

采用高效液相色谱法定量槲皮素浓度，检测微球的载药量和包封率。将4 mg G-quercetin复合微球溶解在乙腈中，15 000 r/min离心5 min获得澄清的上清液。将上清液装入色谱柱(内径4.6 mm, 长度150 mm, 粒径5 μm),并以甲醇/0.1%磷酸(体积比65∶35)为流动相进行洗脱，流速1 mL/min, 液相色谱仪紫外检测器检测波长369 nm, 计算游离槲皮素质量，测定载药量和包封率。

载药量=(槲皮素总质量-游离槲皮素质量)/微球总质量×100%。

包封率=(槲皮素总质量-游离槲皮素质量)/槲皮素总质量×100%。

1.4 Gm和G-quercetin复合微球SEM检测

微球样本经过冷冻干燥后，表面喷金处理60 s, 在加速电压为10 kV的条件下，通过SEM观察Gm、G-quercetin复合微球的表面微结构及形貌。

1.5 MC3T3-E1细胞培养

使用MC3T3-E1对G-quercetin复合微球进行体外评估。培养条件：37 ℃、5%CO2,每3 d更换一次培养基，待细胞融合80%以上，进行细胞传代。普通培养基：α-MEM培养液、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗。成骨诱导液：根据以往研究，在普通培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C,避光、4 ℃存放。

1.6 细胞分组

根据处理方式将细胞分为对照组(Control组)、明胶微球(Gm)组、G-quercetin组。对照组(Control组):仅接种MC3T3-E1。Gm组：将Gm放置在组织培养板后，接种MC3T3-E1。G-quercetin组：将G-quercetin(浓度1 μg/mL)放置在组织培养板后，接种MC3T3-E1。Gm微球和G-quercetin复合微球均经辐照灭菌。

1.7 细胞黏附检测

将细胞接种在玻璃底培养皿中，接种密度1×104 个/孔。培养24 h后，弃去原有培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，根据试剂盒说明书，FITC-鬼笔环肽标记细胞骨架，DAPI标记细胞核，激光共聚焦显微镜下观察。

1.8 细胞活性和增殖检测

活死细胞染色法观察细胞活性，将细胞接种在玻璃底培养皿中，接种密度为1×104 个/孔。培养24 h后，弃去原有培养基，根据试剂盒说明书，对细胞进行染色，激光共聚焦显微镜下观察结果并拍照。

CCK-8法检测细胞增殖。将细胞接种在96孔板，接种密度5×103个/孔。培养1、4、7 d后，弃去原有培养基，根据试剂盒说明书，每孔加入110 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育1.5 h, 于酶标仪上测定在450 nm波长处的光密度(OD)值。

1.9 RT-PCR检测

将细胞以1.5×105个/孔的密度接种在6孔板，成骨诱导培养7 d后提取细胞RNA,逆转录后得到cDNA, RT-PCR检测成骨相关基因Runx-2、ALP、OCN、OPN的表达量。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。定量PCR引物序列见表1。

1.10 碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色检测

将细胞以5×104个/孔密度接种于24孔板，成骨诱导液培养7 d后，根据试剂盒说明书，将样品进行ALP染色，显微镜下观察并拍照。

成骨诱导液培养28 d后茜素红染色检测细胞外基质矿化的程度。在2.5%戊二醛溶液中固定15 min后，使用茜素红(1%,pH 4.3)对样品进行染色，显微镜下观察并拍照。

表1 引物序列

1.11 统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件对所获数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),各组间比较采用Tukey法及LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 微球制备

制备的Gm和G-quercetin两种微球结构相似，大小均匀，直径约80 μm, 球形完整，表面有孔结构，界面光滑，无明显杂质(图1)。

G-quercetin复合微球槲皮素的载药量为(6.97±0.11)%,包封率为(91.04±1.56)%。表明槲皮素可以高效地被装载在明胶微球中，有效控制槲皮素浓度。

图1 微球表面形貌的扫描电镜图  

2.2 细胞黏附

细胞黏附结果如图2所示，绿色荧光为细胞骨架，蓝色荧光为细胞核。各组细胞均可见细胞伸展良好。

图2 MC3T3-E1细胞黏附情况

2.3 细胞活性

活死细胞染色结果如图3所示，各组细胞细胞活力均良好，均未见大量红色荧光染色的死细胞(图3)。

图3 MC3T3-E1细胞活力   

红色荧光染色为死细胞，绿色荧光染色为活细胞。

2.4 细胞增殖

细胞增殖结果显示，培养细胞1、4、7 d后，各组细胞OD值无显著性差异(P>0.05),G-quercetin微球不影响细胞的增殖(图4)。

2.5 成骨相关基因表达情况

与Control组相比，Gm组Runx-2、ALP、OCN、OPN mRNA表达无明显差异(P>0.05);而G-quercetin组Runx-2、ALP、OCN mRNA表达明显增高(P<0.01),OPN mRNA也明显上调(P<0.05)(图5)。

图4 CCK-8法检测细胞增殖活性

2.6 ALP染色及茜素红染色

培养7 d后，Gm组、G-quercetin组细胞ALP染色明显均较Control组颜色深，且G-quercetin组染色较Gm组更深(图6)。说明在矿化诱导条件下，G-quercetin微球对MC3T3-E1的ALP表达具有更强的促进作用。

培养28 d后，与Control组相比，Gm组仅有部分小矿化结节，G-quercetin组明显出现更多的矿化结节，染色明显，结节更大(图7)。

图5 成骨相关基因表达

图6 碱性磷酸酶染色检测结果   

3、讨论

骨质疏松症是一种系统性骨病[18],患者的代谢变化也会影响口腔种植体周围组织愈合，进而影响骨结合。雌激素可以促进骨骼形成及钙吸收，使用雌激素作为一种绝经后骨质疏松的替代疗法在临床上已应用多年[19,20,21,22],但长期应用雌激素具有胃肠道不适、体重增加、乳腺增生、子宫内膜病变等副作用，治疗受到限制[23,24]。槲皮素因结构与雌激素类似，可作为雌激素替代物发挥作用。通过雌激素受体激活BMP/smad信号通路可能是槲皮素发挥药理作用的机制之一[25]。本研究成功制备了G-quercetin微球，有望更安全地促进骨形成。

图7 茜素红染色检测结果

本实验采用明胶制备的微球作为载药体系，明胶由动物胶原部分水解而成，在体温高于37 ℃会逐渐软化并溶解，具有良好的生物可降解性能[26,27,28]。负载了槲皮素的明胶微球具有良好的生物相容性，且不影响细胞活性、黏附、增殖，与以往研究结果一致[29,30]。有研究显示槲皮素能够促进创面愈合和人口腔角质细胞增殖，具有较强的抗氧化性和抗炎性[31],对牙周组织具有保护作用[32],提示该微球在骨组织工程中具有应用潜力。

淫羊藿苷、染料木素和山柰酚等黄酮类化合物作为雌激素替代品已被证明具有类雌激素效应，通过与雌激素受体结合，发挥抗细胞衰老作用，增加骨钙素形成进而促进成骨分化[33,34,35]。本研究发现，在成骨诱导后，负载槲皮素的明胶微球能够促进Runx-2、ALP、OCN、OPN等成骨相关基因的上调，成骨诱导后碱性磷酸酶表达增加，体外矿化结节的形成也明显增多，说明本实验制备的G-quercetin复合微球具有促成骨的性能，也验证了复合微球保留了槲皮素的生物活性。槲皮素通过抑制NF-κB/NLRP3炎性小体通路，有效改善TNF-α诱导的炎症状态下人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)的成骨分化能力[36]。之前的研究报道也显示，雌激素可以通过Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路通路诱导人牙周膜干细胞成骨分化，提高成骨标志物Runx-2、OCN的表达，且两条通路间存在交互串扰[37]。李小云等[38]发现槲皮素能促进骨髓间充质细胞Runx-2及ALP表达，抑制PPARγ及C/EBPα表达；促进成骨分化，抑制成脂分化，可能通过ER信号通路介导完成。也有研究报道显示，槲皮素通过上调SATB2基因的表达促进人骨髓间充质细胞的增殖和成骨分化[34]。有学者对去势骨质疏松症大鼠进行了研究，发现槲皮素处理后其BMP2和Smad4的基因和蛋白表达水平都有升高趋势[39]。槲皮素有效作用靶点与血管生成，骨、脂质代谢和炎症反应等过程相关，主要有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路和IL-17信号通路等[40]。本研究仍需进一步探索明确槲皮素促进成骨分化的内在分子机制。

本研究成功制备了负载槲皮素的明胶微球，其具有良好的生物相容性，且在体外具有促成骨分化和矿化的能力。因此有希望作为一种良好的骨组织工程材料发挥作用。在后续的研究中，仍需进一步验证微球在骨缺损修复和骨再生动物模型中的体内应用，发挥其在骨组织工程中的治疗作用。

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基金资助:国家自然科学基金(82100963); 嘉兴市科技局项目(2024AD10025);

文章来源:董伟杰,苏庭舒,忻贤贞.载槲皮素明胶微球对MC3T3-E1增殖和分化的影响[J].口腔医学,2024,44(07):494-499.