镉(cadmium, Cd)是我国食品安全重点关注的重金属污染物之一，其可通过食物链途径进入机体，造成肝脏、肾脏和睾丸等多器官损伤[1,2]。前期研究以小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells, TM3)构建镉致生殖细胞毒性模型，发现镉可以诱导TM3细胞凋亡[3]。但有关镉致生殖细胞毒性的机制仍需进一步探讨。

微小RNA(microRNAs, miRNAs)是一类长度约20～25个核苷酸的RNA分子，属于非编码RNA的一种，可调节其它基因的表达。近年来研究发现miRNA对细胞凋亡发挥着重要的调控作用[4,5]。miR-221-3p是一种miRNA,与细胞凋亡、氧化应激和炎性反应等多种生理过程相关[6,7],使用CdCl2处理胰腺导管腺癌细胞后，miR-221-3p显著过表达[8],诱导细胞凋亡。DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)是一种进化保守蛋白，由232个氨基酸组成，在基础条件下低表达，但在各种细胞刺激下明显过表达，包括氧化损伤、内质网应激等，可参与细胞的凋亡、自噬和炎症[9]。

睾丸间质细胞又称Leydig细胞，机体内约有95%的睾酮由睾丸间质细胞提供[10]。故本研究以镉致TM3损伤为细胞模型，以转录组测序技术筛选出的miR-221-3p为代表，验证其靶向下游基因DDIT4,进而探究其对镉致TM3细胞凋亡的调控作用及机制，为镉致雄性生殖毒性的靶向治疗研究提供参考。

1、材料与方法

1.1 仪器与试剂

倒置荧光显微镜(Olympus, 德国),Bio-rad凝胶成像系统(Bio-rad, 美国)。小鼠睾丸间质细胞TM3细胞系购于中国科学院细胞库；CdCl2购于美国Sigma公司；CCK8试剂盒购于徐州微科曼德生物工程有限公司；Hoechst 33258染色试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒购于江苏碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)试剂SYBR green master mix购于南京诺维赞生物科技有限公司；RNA TransMate转染试剂购于上海生工生物有限公司；miR-221-3p、U6、DDIT4、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物、miR-221-3p模拟物、DDIT4野生型/突变型质粒均由上海生工生物有限公司设计合成。DDIT4、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, BAX)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、GAPDH一抗和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗购于美国Proteintech公司。

1.2 细胞培养

TM3细胞使用DMEM/F-12培养液，另加5%马血清、2.5%胎牛血清和1%的青霉素及链霉素，培养于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱。在细胞密度达到60% 左右进行染毒处理。

1.3 细胞活力检测

TM3细胞以1.5×104个/mL接种于96孔板，培养24 h细胞贴壁后，更换新的培养基，其中镉浓度分别为0、10、20、30和40 μmol/L,各组设置5个复孔，同时设置调零孔。每孔加入10 μL CCK-8,37 ℃孵育2 h, 酶标仪检测450 nm波长的吸光度值，计算细胞存活率。

1.4 转录组测序及生物信息学分析

用20 μmol/L的CdCl2处理TM3细胞24 h, 与对照组细胞同时用TRIzol提取总RNA,转录组测序由北京天根生化科技有限公司完成。测序筛选出差异表达倍数大于1.2倍的miRNAs。Starbase、Targetscan、miRDB和miRmap等在线软件预测靶基因。蛋白互作网络图由Cytoscape 3.9.1完成，相关性分析热图由RStudio完成。

1.5 实时荧光定量PCR验证基因表达

TRIzol法提取各处理组总RNA,逆转录成cDNA,采用SYBR Green荧光染料法完成检测。miRNA以U6为内参，mRNA以GAPDH为内参。通过2-△△CT法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

1.6 细胞转染

TM3细胞以2.5×105个/mL接种于6孔板，细胞密度达60%～90%进行转染。将miR-221-3p模拟物和模拟物阴性对照转染至TM3细胞，miR-221-3p模拟物(20 pmol/μL)与RNA TransMate的用量比例为1∶6,转染24 h后，再联合镉染毒24 h, 分别记作空白对照组、阴性对照组、镉染毒组、镉染毒+miR-221-3p模拟物组，对照组不做处理。收集细胞用于后续实验。

表1 基因引物名称及其序列

1.7 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

TM3细胞以2.5×105个/mL接种于6孔板，转染miR-221-3p模拟物后镉染毒24 h, PBS(pH 7.2)洗一遍，0.5 mL固定液处理20 min, PBS洗两遍，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液(10 mg/mL)避光染色20 min, PBS洗两遍，加一至两滴抗荧光淬灭液后，荧光显微镜下观察细胞核的改变并拍照。

1.8 Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡

TM3细胞以2.5×105个/mL接种于6孔板，转染miR-221-3p模拟物后镉染毒24 h, 用不含EDTA的胰酶消化细胞，1000 r/min离心5 min, 弃上清，加入500 μL的Binding Buffer吹匀成单细胞悬液；加入5 μL Annexin V-FITC(50 μg/mL)混匀后，加入5 μL Propidium Iodide(50 μg/mL)混匀；避光染色10 min[3],1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 双荧光素酶报告基因实验

TM3细胞以5×104个/mL接种于24孔板中，细胞密度达60%～90%时，取8支1.5 mL无菌EP管各加入25 μL无血清培养基，其中4支各加入1.5 μL RNA TransMate转染试剂，另外4支分别加入0.5 μg DDIT4野生型质粒(DDIT4-WT)、突变型质粒(DDIT4-Mut)与0.75 μL miR-221-3p模拟物/阴性对照(15 pmol/μL),混匀静置5 min, 随后两两混合，充分混匀后静置20 min形成转染混合物[11],细胞换液后加入转染混合物，分别记作DDIT4野生型质粒+阴性对照组、DDIT4野生型质粒+miR-221-3p模拟物组、DDIT4突变型质粒+阴性对照组、DDIT4突变型质粒+miR-221-3p模拟物组。24 h后每孔加入200 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min, 12 000 r/min离心5 min, 取上清液加入96孔板，在暗室加入100 μL萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶检测液，测定相对光单位(relative light unit, RLU)值，归一化后分析。

1.10 Western blot测定蛋白表达水平

收集各处理组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；使用30～40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、一抗(1∶1000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；二抗(1∶10000)室温孵育2 h, TBST洗膜；ECL混合液化学发光显影各条带。采用Image J分析软件进行条带灰度值分析，并以GAPDH灰度值进行校正。

1.11 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示。使用GraghPad Prism 8.4.3软件进行作图，SPSS 26.0软件进行统计学分析。两样本指标比较采用t检验，多组间指标的比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用SNK法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 镉对TM3细胞活力的影响

由表2可见，镉染毒显著降低了TM3细胞活性，20 μmol/L镉处理TM3细胞24 h, 细胞活力为54.53%±0.36%,与前期研究结果基本一致[12]。为进一步探讨上游微小RNA对镉致TM3细胞凋亡的影响和机制，因此后续实验仍采用20 μmol/L的镉作为染毒浓度。

表2 镉对小鼠睾丸间质细胞活力的影响

2.2 镉致TM3细胞miRNAs的差异表达

转录组测序共筛选出25个差异表达显著的miRNAs, 6个下调，19个上调(表3)。在下调的miRNAs中，镉引起miR-221-3p的差异表达最为显著。通过qRT-PCR验证表明测序结果可靠(图1)。因此本研究以miR-221-3p为代表，进一步研究其对镉致TM3细胞凋亡的调控作用。

表3 镉致小鼠睾丸间质细胞25个差异表达miRNAs基因列表

图1 qRT-PCR验证测序结果   

2.3 过表达miR-221-3p抑制镉诱导TM3细胞凋亡

由图2可见，与对照组相比，光镜下镉染毒组TM3细胞缩小变圆，间距变大；Hoechst荧光染色显示镉染毒组细胞出现染色质凝聚、核致密浓染等细胞凋亡特征。阴性对照组与空白对照组相比，细胞形态和细胞核染色无明显变化；而镉染毒+miR-221-3p模拟物组与镉染毒组相比，正常形态细胞数量增多，浓染细胞或凋亡细胞明显减少(图2A-B)。流式细胞仪分析显示，镉染毒组(细胞活力54.53%±0.36%)细胞凋亡率明显高于对照组，而镉染毒+miR-221-3p模拟物组与镉染毒组比较，细胞凋亡率降低(图2C-D)。转染miR-221-3p模拟物后，miR-221-3p表达上调(图2E),表明转染效果良好。

图2 过表达miR-221-3p抑制镉诱导的小鼠睾丸间质细胞(TM3)凋亡(×20 μm)  

2.4 过表达miR-221-3p下调DDIT4基因表达

使用4种软件共同预测miR-221-3p下游靶点，韦恩图及靶点图均显示DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一(图3A-B)。miR-221-3p 过表达后，DDIT4的mRNA及蛋白表达水平均显著下调(图3C-D)。miR-221-3p与DDIT4的3’非编码区的保守结合区域如图3E。双荧光素酶报告分析结果显示，过表达miR-221-3p削弱了DDIT4野生型质粒的荧光素酶活性，但对DDIT4突变型质粒的荧光素酶活性无显著影响(图3F)。

图3 过表达miR-221-3p下调DNA损伤诱导转录本4(DDIT4)基因表达   

2.5 镉染毒TM3细胞DDIT4基因表达上调及其功能分析

转录组测序结果显示，镉染毒组DDIT4表达升高且有统计学意义(P=1.28×10-8)。使用镉染毒TM3细胞后，DDIT4的mRNA和蛋白水平均显著上调(图4A-B)。对DDIT4进行GO功能分析，分子功能主要是与特定蛋白结合；生物过程包括细胞分化、应激、细胞程序性死亡及调控TOR信号通路等；细胞组分为线粒体和胞浆，且DDIT4主要定位于线粒体和胞浆(图4C-D)。对DDIT4与细胞凋亡相关基因进行蛋白质网络互作及相关性分析，发现DDIT4与mTOR、Bcl-2及BAX等内源性凋亡基因之间存在相互作用(图4E),且呈现正相关或负相关性(图4F)。

图4 镉染毒TM3细胞上调DNA损伤诱导转录本4(DDIT4)基因表达及其功能分析  

2.6 过表达miR-221-3p通过DDIT4调控镉诱导的TM3细胞凋亡蛋白表达

TM3细胞经转染、染毒处理后，结果显示，镉染毒组DDIT4、BAX表达水平上调，Bcl-2表达水平下调，Bcl-2/BAX比例降低；而镉染毒+miR-221-3p模拟物组与镉染毒组相比，下调了DDIT4、BAX的表达水平，上调了Bcl-2的表达水平，Bcl-2/BAX比例升高(图5)。

3、讨论

miRNA是一类长度约20～25个核苷酸的RNA分子，属于非编码RNA的一种，可参与一系列生物学进程，包括细胞凋亡、增殖等。在一种新型的调控机制——竞争性内源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)[13,14]中，miRNA可通过与mRNA竞争或结合，抑制其翻译或者导致其降解，从而实现转录后调控基因表达的功能[15]。

miR-221-3p能调控细胞的多种生理过程，如细胞凋亡、氧化应激和炎性反应等。有研究表明，三七皂苷通过调节miR-221-3p靶向TRAF6基因，缓解氧化性低密度脂蛋白诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡[16];miR-221-3p也可以通过Hedgehog途径靶向FOXP2抑制人甲状腺癌细胞凋亡[17]。本研究发现，转录组测序筛选出由镉引起差异表达的25个miRNAs, 其中miR-221-3p表达水平下调，qRT-PCR验证与测序结果一致(P<0.01)。此外，镉染毒组细胞出现明显的凋亡形态学改变，与对照组相比凋亡率升至，而镉染毒+miR-221-3p模拟物组与镉染毒组相比，凋亡细胞明显减少，表明过表达miR-221-3p可抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

图5 过表达miR-221-3p通过DNA损伤诱导转录本4(DDIT4)调控镉诱导的TM3细胞凋亡蛋白表达

DDIT4在生物、生理功能和细胞功能中发挥着至关重要的作用，可参与细胞的生长、炎症、自噬和凋亡等一系列生理过程。有研究发现，DDIT4的表达可启动内源性凋亡途径，激活细胞色素C从线粒体向细胞质释放，然后促进胱天蛋白酶的裂解，最终导致细胞凋亡[18];沉默DDIT4可以降低甲基苯丙胺诱导的心肌细胞凋亡和自噬[19];此外，DDIT4也可以通过上调抗凋亡分子Bcl-2的表达和Bcl-2/BAX的比例来抑制心肌细胞凋亡[20]。本研究结果发现，镉染毒组DDIT4表达上调且有统计学意义(P<0.05),与测序结果一致；靶基因预测及各种实验结果表明DDIT4是miR-221-3p下游的直接作用靶点之一；生物信息学分析表明DDIT4与细胞凋亡之间存在联系；与镉染毒组相比，镉染毒+miR-221-3p 模拟物组DDIT4的表达水平下调，且Bcl-2与BAX的比值增加，表明过表达miR-221-3p可通过下调DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

综上所述，镉染毒TM3细胞中miR-221-3p的表达水平下调，而DDIT4的表达水平升高，过表达miR-221-3p可负向调控靶基因DDIT4的表达，进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡，其可能作为镉引起的雄性生殖毒性治疗的潜在靶点之一，但对于DDIT4在调控镉诱导的TM3细胞凋亡中发挥的具体作用仍需进一步研究。

参考文献:

[3]林芮,骈雅婧,张朝钦,等.N-乙酰半胱氨酸激活蛋白激酶B通路减轻镉诱导的睾丸间质细胞凋亡[J].卫生研究,2022,51(4):632-637.

[11]李淑勤,赵树强,郑丽琴.MiR-221-3p靶向FGF14调控肺腺癌细胞增殖､凋亡､迁移及侵袭的分子机制[J].中国免疫学杂志,2022,38(7):827-832.

[12]胡昕迪,张朝钦,王苏苏,等.Nano-Se对镉致睾丸间质细胞凋亡保护作用的研究[J].营养学报,2019,41(6):601-605.

基金资助:国家自然科学基金(No.81302429);江苏省研究生科研与实践创新计划项目(No.KYCX21_2726);

文章来源:罗皓珑,陈梦圆,骈雅婧,等.微小RNA-221-3p通过DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡机制[J].卫生研究,2024,53(03):478-486.