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纳米三氧化二铁经口暴露对雄性大鼠生殖系统的影响

2024-05-20 29 上传者：管理员

摘要：目的探讨纳米三氧化二铁颗粒(iron oxide nanoparticles, Fe2O3NPs)经口暴露对雄性大鼠生殖系统的影响。方法将40只雄性SD大鼠按体重随机分配到对照组和低、中、高剂量干预组，每组10只，分别灌胃生理盐水和50、100、200 mg/kg的Fe2O3NPs混悬液，每次灌胃体积10 mL/kg,连续灌胃28 d,每3天称一次体重，记录大鼠体重变化。10%水合氯醛腹腔麻醉后，脱颈处死大鼠，收集睾丸和附睾。称重并计算睾丸系数和附睾系数，苏木精-伊红染色观察大鼠睾丸组织病理学切片，光学显微镜下统计附睾精子数目、计算精子畸形率，试剂盒法检测大鼠睾丸组织匀浆中组织标志酶酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和γ-谷氨酰转肽酶活性，以及氧化应激指标超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽、丙二醛含量。结果与对照组相比，各剂量Fe2O3NPs干预组大鼠体重、睾丸系数及附睾系数差异无统计学意义；100和200 mg/kg组生精上皮排列紊乱、生精细胞减少；200 mg/kg组精子数目减少，100和200 mg/kg组精子畸形率增加(P<0.01);100和200 mg/kg组酸性磷酸酶活性升高(P<0.05)、γ-谷氨酰转肽酶活性降低(P<0.01);100 mg/kg组谷胱甘肽水平升高(P<0.05),100和200 mg/kg组丙二醛含量升高(P<0.01)。结论 Fe2O3NPs可引起大鼠睾丸组织结构损伤，精子数目减少，精子畸形率增高，干扰睾丸组织标志酶活性并诱导氧化应激，对雄性大鼠生殖系统造成了不利影响。

关键词：
Fe2O3NPs
消化道暴露
生殖毒性
纳米氧化铁
纳米颗粒
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纳米颗粒因性能优良被广泛应用于医疗、化工、电子和食品等多个领域。在食品领域，纳米三氧化二铁颗粒(iron oxide nanoparticles, Fe2O3NPs)常用于蛋糕、甜点混合物等烘焙食品以及肉酱等的着色[1]。随着Fe2O3NPs在食品行业的大量使用，人体经消化道暴露的机会日益增多。然而，Fe2O3NPs的安全性尚未得到充分评估[2]。近年来人类男性精子质量显著下降，全球男性平均精子浓度从1973年的101×106/mL下降到2018年的49×106/mL,且精子数量下降约62%[3]。男性生殖系统相比于其他器官系统更加敏感脆弱，易受到包括纳米颗粒在内的各种环境因素的干扰。研究发现纳米颗粒可能对男性生殖系统产生潜在毒性，如精子浓度降低、形态异常和生殖激素紊乱等[4]。本研究以Fe2O3NPs为实验材料，建立不同剂量下28天经口暴露的雄性大鼠动物模型，从大鼠体重、生殖脏器系数、睾丸组织病理学、附睾精子数目和精子畸形率、睾丸组织标志酶活性以及氧化应激指标等方面，初步探讨Fe2O3NPs对雄性大鼠生殖系统的影响。

1、材料与方法

1.1 受试物

Fe2O3NPs(上海超威纳米科技有限公司),纯度>99.9%,透射电子显微镜下呈团聚状态，不规则棒状结构，平均粒径(70±10)nm, 具体表征信息见前期研究[5]。

Fe2O3NPs混悬液配制：Fe2O3NPs与生理盐水混合配制成浓度为0.005、0.01和0.02 g/mL的混悬液，灌胃前冰浴超声30 min, 使其尽可能解聚分散，现配现用。

1.2 主要仪器和试剂

超声波清洗机(深圳市洁萌清洗设备有限公司),酶标仪(PerkinElmer公司),高速匀浆机(美国MPbiomedicals公司),高速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器公司),电子天平(德国Sartorius公司),电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)。

生理盐水(成都豪乙生物科技有限公司),BCA蛋白含量检测试剂盒及酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transferase, γ-GT)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)测定试剂盒(均来自南京建成生物工程研究所)。

1.3 实验动物及分组处理

7～8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体重250～300 g, 购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011。在四川大学华西公共卫生学院屏障级动物房饲养，许可证号SYXK(川)2018-011。动物房内清洁通风，室温22～26 ℃,相对湿度40%～70%,昼夜交替12 h/12 h。本实验已获四川大学医学伦理委员会审查批准。

大鼠适应性喂养7 d后，按体重随机分为4组：对照组和Fe2O3NPs低、中、高剂量组，每组10只。依据食品添加剂联合专家委员会(JECFA)的规定，氧化铁红每日允许摄入量为0～0.5 mg/kg[6],另外根据《食品安全国家标准 28天经口毒性试验》[7]的要求，对于无法确定半数致死剂量的受试物，其剂量设计尽可能涵盖人体预期摄入量的100倍，至少有3组剂量并间隔2～4倍。故分别向对照组和低、中、高剂量组大鼠给予生理盐水和50、100和200 mg/kg的Fe2O3NPs混悬液灌胃，每次灌胃体积10 mL/kg, 每天同一时段灌胃，连续灌胃28 d。每3天称一次体重，根据大鼠体重变化调整灌胃体积，灌胃期间大鼠自由摄食、饮水。

1.4 样品收集和处理

末次灌胃后，各组大鼠禁食不禁水16 h, 10%水合氯醛腹腔麻醉，脱颈处死后快速解剖出睾丸及附睾，于-80 ℃冻存。

1.4.1 计算脏器系数

用预冷的生理盐水漂洗双侧睾丸和附睾，滤纸吸干水分，称取重量，计算睾丸系数和附睾系数。脏器系数=脏器重量(g)/动物体重(g)×100。

1.4.2 组织病理学观察

每组随机选取3只大鼠，沿纵轴将睾丸分成两部分，4%多聚甲醛固定48 h, 梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，最后用苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察。

1.4.3 精子质量检测

取单侧附睾放入预热36.5 ℃的生理盐水中，剪刀撕开，静置10 min, 制成精子悬液。将适量悬液滴入血细胞计数板内，光学显微镜下观察计数；载玻片滴加20 μL精子悬液，经常规抹片、晾干、甲醇固定5 min, 干燥后用2%伊红染液染色1 h, 蒸馏水冲洗后晾干，镜下观察，计数200个精子，统计畸形精子数，计算精子畸形率。

1.4.4 睾丸组织标志酶活性和氧化应激指标检测

将大鼠睾丸组织和预冷的生理盐水按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例混合，制备组织匀浆，然后2500 r/min离心10 min, 取上清待测，按试剂盒说明操作，检测ACP、AKP、LDH和γ-GT的活力，以及SOD活性和总蛋白、GSH、MDA含量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，GraphPad Prism9.5作图。数据用表示，若数据服从正态分布，组间比较采用单因素方差分析：若方差齐，用LSD法；方差不齐，用Games-Howell检验。若数据不服从正态分布，组间差异比较使用独立样本的Kruskal-Wallis H检验。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 大鼠体重和生殖脏器系数

由表1可见，Fe2O3NPs灌胃对大鼠体重、睾丸系数和附睾系数均无影响。

表1 纳米三氧化二铁(Fe2O3NPs)经口暴露对大鼠体重和睾丸、附睾系数的影响

2.2 睾丸组织病理学

如图1可见，对照组和50 mg/kg Fe2O3NPs组睾丸组织被膜完整，实质内生精小管管腔大小不一，呈圆形或卵圆形，管壁由基膜和复层上皮组成，薄层基膜紧贴上皮，上皮较厚，可见不同分化阶段的生精细胞，各级生精细胞形态较为正常、排列基本整齐，从基膜到腔面依次可见精原细胞、精母细胞、精子细胞，管腔内充满精子。100 mg/kg组部分生精上皮排列紊乱，管腔内各级生精细胞减少，精子减少。200 mg/kg组生精小管间隙增宽，生精上皮排列紊乱，各级生精细胞明显减少，管腔内精子极少。

图1 纳米三氧化二铁经口暴露对大鼠睾丸组织病理学的影响(HE染色)

2.3 精子数目和精子畸形率

由表2可见，与对照组相比，200 mg/kg Fe2O3NPs组精子数目减少(P<0.01),100和200 mg/kg组精子畸形率增高(P<0.01);与50 mg/kg组相比，200 mg/kg组精子数目减少(P<0.05),且精子畸形率增高(P<0.01)。畸形精子形态见图2。

表2 纳米三氧化二铁(Fe2O3NPs)经口暴露对大鼠精子数目和精子畸形率的影响

图2 纳米三氧化二铁经口暴露致大鼠精子畸形形态

2.4 睾丸组织标志酶活性

由表3可见，与对照组相比，100和200 mg/kg Fe2O3NPs组ACP活性升高(P<0.01,P<0.05),γ-GT的活性降低(P<0.01);与50 mg/kg组相比，100 mg/kg组ACP活性升高(P<0.05)。

2.5 睾丸组织氧化应激指标

由表4可见，与对照组相比，100 mg/kg Fe2O3NPs组GSH水平升高(P<0.05),100和200 mg/kg组MDA含量升高(P<0.01);与50 mg/kg组相比，100和200 mg/kg组GSH水平和MDA含量均升高(P<0.01)。

表3 纳米三氧化二铁(Fe2O3NPs)经口暴露对大鼠睾丸组织标志酶活性的影响

表4 纳米三氧化二铁(Fe2O3NPs)经口暴露对大鼠睾丸组织氧化应激指标的影响

3、讨论

Fe2O3NPs在食品行业大量使用，增加了人体经口暴露的潜在风险，而研究表明摄入纳米颗粒会对男性生殖系统产生不良影响，本研究建立28天经口暴露Fe2O3NPs的雄性大鼠模型，研究结果显示灌胃100～200 mg/kg的Fe2O3NPs后，大鼠睾丸组织结构受损，精子数量减少、畸形率增高，睾丸组织标志酶活性改变并诱导氧化应激，对雄性大鼠生殖系统造成损害。

体重和脏器系数是衡量动物生长状况以及反映化学物毒性作用的基本指标。本研究结果显示，50～200 mg/kg Fe2O3NPs灌胃28 d未明显影响到大鼠体重、睾丸及附睾的生长。可能是由于本实验Fe2O3NPs的暴露时间较短，对大鼠体重和生殖脏器系数的影响很小。也可能是经口暴露方式下Fe2O3NPs的吸收率较低，部分Fe2O3NPs经大鼠尿液和粪便排出[8]。对此可延长暴露时间或更换暴露途径做进一步研究。

睾丸组织病理学结果显示，与对照组比较，100和200 mg/kg Fe2O3NPs组出现不同程度的生精上皮排列紊乱、各级生精细胞减少等现象。有研究显示给雄性小鼠连续4周腹腔注射25和50 mg/kg Fe2O3NPs后，观察到生精细胞变性、生精小管空泡化等现象[9],与本研究结果基本一致，说明Fe2O3NPs会对睾丸组织结构造成破坏。

精子数目、形态和畸形率是评估男性生殖健康的重要指标。有研究发现大鼠连续79 d经口暴露5 mg/kg Fe2O3NPs后，精子数量显著降低且精子畸形率增高[10]。本研究结果显示，与对照组比较，200 mg/kg组大鼠精子数目降低(P<0.01),100和200 mg/kg组大鼠精子畸形率增高(P<0.01),说明Fe2O3NPs引起大鼠精子数目减少和形态异常，影响精子的正常发生与成熟过程。同时，此结果也与本研究睾丸组织病理学结果相吻合。

睾丸组织标志酶与睾丸功能密切相关，对精子发生和成熟非常重要[11]。本研究结果表明，暴露于Fe2O3NPs后睾丸组织标志酶活性改变。100和200 mg/kg组较对照组ACP活性升高(P<0.01,P<0.05),与Hu等[12]的研究结果一致，说明睾丸组织内通过上调ACP活性来清除损伤细胞，提示暴露于Fe2O3NPs后，睾丸内受损细胞增多，大鼠睾丸组织损伤程度增加，这也与睾丸组织病理学部分的结果相吻合。与对照组比较，100和200 mg/kg组γ-GT活性水平降低(P<0.01),且具有剂量-效应关系，说明Fe2O3NPs损伤了支持细胞功能，有证据表明支持细胞的功能影响精子能否正常发生[13],此结果正与精子数目和畸形率部分的结果相吻合。

纳米颗粒产生的生殖毒性可能与其诱导的氧化应激有关。SOD和GSH是内源性抗氧化剂，对抵御活性氧、维持睾丸正常的生殖功能非常重要，MDA则是监测脂质过氧化的关键生物标志物[14]。AHMED等[15]给大鼠连续8周腹腔注射Fe2O3NPs后，观察到3.5和7 mg/kg剂量组睾丸组织内MDA含量升高，GSH和SOD活性降低，诱导了睾丸组织氧化应激。本研究结果显示，与对照组相比，100 mg/kg组GSH水平增高(P<0.05),100和200 mg/kg组 MDA含量增加(P<0.01)且具有剂量-效应关系，说明Fe2O3NPs引起大鼠睾丸氧化应激，产生大量自由基，脂质过氧化反应明显。其中100 mg/kg组GSH水平较对照组增高，与AHMED等[15]的结果相反，可能是Fe2O3NPs暴露剂量不同引起的差异，当Fe2O3NPs处于较低剂量时，引起轻度的氧化应激，从而消耗了GSH;而本实验Fe2O3NPs处于较高剂量，诱导大鼠体内产生更多自由基，为了维持氧化还原平衡，机体则通过产生更多GSH来清除自由基。各组SOD活性没有明显差异，可能是睾丸内各抗氧化酶之间协同发挥作用的相互关系复杂，对此还需要深入研究。

铁过载往往会对雄性生殖系统造成负面影响。大鼠长期膳食铁超量摄入导致睾丸组织内铁蓄积，抗氧化酶活性改变，发生氧化应激[16]。LUCESOLI等[17]探讨急性铁摄入过量对大鼠睾丸组织的影响，结果显示睾丸内受到氧化应激损伤和精子发生障碍，250、500 mg/kg组的睾丸组织病理学检查结果与对照组相比几乎没有差异，1000 mg/kg组生精小管轻度萎缩，管腔内无精子细胞。本研究结果显示，与对照组相比，100、200 mg/kg剂量组出现生精上皮排列紊乱、管腔内各级生精细胞和精子剂量依赖性的减少，同时睾丸标志酶活性改变，睾丸组织发生氧化应激损伤。与铁比较，Fe2O3NPs在更低的剂量下对大鼠睾丸组织结构产生了同样甚至更强的毒性作用。就目前的研究结果而言，纳米材料的安全性的确值得关注。

综上，本研究发现Fe2O3NPs连续28天经口暴露后，对雄性大鼠生殖系统产生了不利影响。本研究仅对Fe2O3NPs的生殖毒性进行了初步探讨，后期可考虑纳入对性激素水平的研究。同时，纳米颗粒的毒性受其理化性质、结构、暴露时间和剂量等多方面的影响，因此Fe2O3NPs对雄性大鼠生殖系统的影响还可作进一步探讨，以便为其安全性评估提供充分依据。

参考文献:

[7]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 28天经口毒性试验:GB 15193.22—2014 [S].北京:中国标准出版社,2014.

[8] 刘洋,王雪,邵黄芳,等.重复经口暴露氧化铁纳米颗粒在大鼠体内的分布和排泄[J].现预防医学,2022,49(19):3565-3571.

[13]席海灵,高艳荣,王素华,等.三种典型纳米颗粒物对雄性大鼠的生殖毒性[J].环境与健康杂志,2018,35(1):39-43.

基金资助:国家重点研发计划(No.2017YFC1600204);

文章来源:赵靖,苏欣怡,侍江春,等.纳米三氧化二铁经口暴露对雄性大鼠生殖系统的影响[J].卫生研究,2024,53(03):435-440.