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基于生物信息学分析的弓形虫TgSUB3多抗制备

2024-06-20 13 上传者：管理员

摘要：目的在利用生物信息学全面分析TgSUB3序列的基础上，制备针对该蛋白B细胞抗原表位的兔源多克隆抗体。方法采用生物信息学软件对TgSUB3蛋白的理化性质、空间结构、磷酸化/糖基化位点、B细胞抗原表位等进行分析。用原核表达、纯化的TgSUB3重组蛋白免疫新西兰大白兔，于4次加强免疫后第7 d制备兔血清，采用Protein A亲和纯化抗体蛋白，分别利用SDS-PAGE和ELISA分析抗体纯度和效价。结果生物信息学分析TgSUB3为不稳定亲水性蛋白，无信号肽，跨膜区为19-39aa,包含1个Peptidases＿S8结构域(358-617aa)。二级结构中无规卷曲占51.29%,α螺旋占26.11%。TgSUB3包含65个磷酸化位点和126个糖基化位点。B细胞抗原表位区集中在45-290aa和715-937aa。SDS-PAGE显示纯化的TgSUB3多抗为单一55 ku条带，ELISA检测TgSUB3抗体滴度为1:102 400。结论成功制备了兔源TgSUB3抗血清，经纯化获得高纯度高滴度的多抗。

关键词：
SUB3蛋白
多克隆抗体
弓形虫
核细胞
生物信息学
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弓形虫（Toxoplasma gondii,Tg）呈世界性分布，可感染几乎所有温血动物的有核细胞，引发人和多种动物的感染，导致人兽共患弓形虫病。我国人群弓形虫平均感染率约为10%，猪的弓形虫感染率为30%～50%，南方地区鸡的感染率超过20%，北方和西北地区羊的感染率约为20%[1]。畜禽弓形虫感染不但给畜牧养殖业带来经济损失，同时会增加人感染弓形虫的风险。

弓形虫入侵基于多种蛋白协调且机制精细复杂，大多数蛋白需经蛋白酶修饰加工使其功能域展现或形成活性位点才能发挥功能[2]。因此，蛋白酶在弓形虫入侵宿主细胞、逃避宿主免疫机制、参与细胞分化和调节致病机制中发挥重要作用[3,4,5]。

类枯草杆菌蛋白酶（subtilisin-like protease,SUB）属于丝氨酸蛋白酶家族，是广泛分散在进化中的一组古老的蛋白酶。SUB最初以无活性的前蛋白形式存在，一般包括信号肽、前肽结构域（前结构域）和催化结构域。在信号肽被水解后，前结构域被自动催化断裂，但仍以非共价结合状态发挥分子伴侣的作用，用于后续的正确折叠而催化为活性酶。前结构域通常是其同源酶的有效和选择性抑制剂。SUB在功能上具有多样性，但具有保守的催化结构域，催化三联体残基以保守性的Asp-His-Ser排列，在这些残基周围具有容易识别的序列基序[6]。目前已在顶复门原虫中的疟原虫、弓形虫、新孢子虫、隐孢子虫中发现了SUB同源蛋白，分别为PfSUB1、PfSUB2、PfSUB3、TgSUB1、TgSUB2、NcSUB1和CpSUB1[7,8,9,10,11,12,13]。在弓形虫中，TgSUB3是继TgSUB1和TgSUB2发现后被鉴定的第三种SUB，但其定位及功能尚不十分清楚。本研究从TgSUB3序列分析入手，筛选其B细胞抗原表位，针对其表位区制备兔源多抗并进行纯化，为该蛋白的相关研究奠定基础。

1、材料与方法

1材料

1.1载体和菌株

原核表达载体pET30a由本实验室保存。大肠埃希菌TOP10和表达菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

1.2实验动物

体重约2.0kg新西兰大白兔。

1.3主要试剂

胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；HRP标记的羊抗兔IgG和TMB显色试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ购自赛默飞世尔科技有限公司；Ni-NTA亲和层析柱购自美国Sigma公司；Protein A亲和纯化柱购自美国GE公司。

2方法

2.1 TgSUB3基因以及蛋白序列的获取

从ToxoDB获取TgSUB3基因及其编码蛋白序列，登录号为TGME49＿200350，该基因位于弓形虫第VIII染色体上。

2.2 TgSUB3的生物信息学分析

利用ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/）预测TgSUB3相对分子质量﹑等电点﹑氨基酸组成、不稳定指数，脂肪指数和亲水系数；利用SignalP-6.0 (https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）和TOPCONS(https：//topcons.cbr.su.se/pred/）预测TgSUB3的信号肽及跨膜区﹔利用CDD(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析TgSUB3的结构域组成；利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl?page=npsa＿sopma.html）和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org）预测TgSUB3蛋白的二、三级结构；利用NetPhos-3.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）和GPP(http：//comp.chem.nottingham.ac.uk/glyco/）预测TgSUB3的磷酸化位点和糖基化位点；利用STRING(https：//string-db.org）预测其互作蛋白；利用DNAStar预测该蛋白的B细胞抗原表位区。

2.3 pET30a-SUB3-KB表达载体的构建及表达

以已构建的pMD18-T-SUB3为载体，以引物F(5′-AAAGAATTCGAGACAGAACCCCAAAAAC-3′）和R(5′-AAACTCGAGGCCTTTGCTCAGCTGCGG-3′）PCR扩增TgSUB3的抗原表位区（45-290aa），下划线部分为酶切位点。酶切、连接构建表达载体pET30a-SUB3-KB，转化TOP10感受态细胞，经双酶切、测序鉴定的阳性质粒转化表达菌BL21(DE3)pLysS，命名为pET30a-SUB3-KB/BL21 (DE3)pLysS。重组表达菌用终浓度为0.5 mmol/L IPTG诱导2h，采用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况，之后进行蛋白的大量表达及纯化。

2.4蛋白的大量表达及纯化

将过夜培养的菌液转接到500mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至A600为0.6～0.8,0.5mmol/L IPTG 37℃诱导4h。6 000r/min离心5min收集菌体，菌体用20～30mL10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0）溶液吹散，超声波破碎（500 W,60次，每次10s，间隔15s）。20～30mL 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0）重悬超声离心得到的沉淀，静置10min,12 000r/min离心10min，弃上清，重复静置、离心一次。先加入少量的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5～10mL含8M尿素的10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0）溶液溶解蛋白。12 000r/min离心10min，收集上清，取50μL电泳。

2.5 TgSUB3的多抗制备及效价测定

取新西兰大白兔，用纯化的TgSUB3重组表达蛋白免疫4次，免疫之前耳静脉取血，分离血清作为阴性对照。首次免疫纯化蛋白用量为400μg，加强免疫为200μg，均用生理盐水稀释至300μL，加入等体积弗氏佐剂（首次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂），混匀后进行背部皮下多点注射，每次免疫的时间间隔为14d。

第四次加强免疫7d后采血，分离血清，采用ELISA法测定抗体效价。纯化的Tg SUB3重组表达蛋白包被浓度为2μg/m L,多抗血清从1∶200开始作2倍梯度稀释至1∶204800。二抗为HRP-羊抗兔Ig G,加入TMB显色10min后终止反应,用酶标仪双波长(A450/A630)测吸光度A值。试验设PBS空白对照和阴性兔血清(1∶200稀释)对照。结果判读:效价为大于等于1/2最大A值所对应的最小稀释倍数。

2.6 TgSUB3多抗的纯化及其纯度与滴度测定

按照文献[14]的方法纯化TgSUB3多抗,分别采用SDS-PAGE和ELISA进行抗体蛋白的纯度分析和滴度测定。

2、结果

1 TgSUB3的生物信息学分析

1.1理化性质

Tg SUB3基因全长2910bp,编码969个氨基酸,分子质量为104.11497ku,理论等电点5.79,为酸性蛋白。负电荷残基总数为111,其中天冬氨酸55个,谷氨酸56个;正电荷残基总数为90,其中精氨酸54个,赖氨酸36个。Tg SUB3的半衰期为30h,不稳定系数53.33,为不稳定蛋白;脂肪指数为72.30,总平均亲水系数为-0.411,属亲水蛋白。

1.2信号肽、跨膜区以及结构域预测

经Signal P-6.0和TOPCONS预测(图1A、1B),Tg SUB3不存在信号肽序列,跨膜区位于19-39aa(图1)。CDD预测该蛋白358-617aa为Peptidases＿S8结构域,催化三联体位于Asp366、His422和Ser583,推测的活性位点位于Asp366、His422、Ser483、Try484、Gly485、Asn513和Ser583(图2)。

图1 TgSUB3蛋白的信号肽和跨膜区预测分析

图2 TgSUB3蛋白的结构域预测

1.3 TgSUB3的二、三级结构

利用SOPMA分析Tg SUB3蛋白的二级结构(图3A),其中无规卷曲占51.29%,α螺旋占26.11%,延伸链占14.86%,β转角占7.74%。SWISS-MODEL分析Tg SUB3蛋白的三级结构,结果见图3B。

图3 TgSUB3蛋白的二级结构(A)和三级结构(B)预测

1.4 TgSUB3的互作蛋白

预测与Tg SUB3互作的弓形虫蛋白有Tg MIC8、TGME49＿030920和TG-ME49＿090950(图4)。

图4 TgSUB3的互作蛋白预测

1.5 TgSUB3的磷酸化位点和糖基化位点

NetPhos-3.1预测Tg SUB3序列分值大于0.8的磷酸化位点共有65个,包含47个丝氨酸磷酸化位点,12个苏氨酸磷酸化位点,6个酪氨酸磷酸化位点(图5)。GPP预测Tg SUB3包含126个糖基化位点。

图5 Tg SUB3蛋白磷酸化位点预测

1.6 TgSUB3的抗原表位区

根据DNAStar对TgSUB3亲水性、抗原指数、表面可及性分析的预测结果,当亲水性>0、抗原指数>0、表面可及性>1时形成抗原表位的可能性大[15]。因此,该蛋白B细胞抗原表位集中在45-290aa和715-937aa（图6）。

图6 TgSUB3蛋白的亲水性、表面可及性和B细胞抗原表位预测

2 TgSUB3重组蛋白的表达及纯化

pET30a-SUB3-KB/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导后表达的目的蛋白分子质量为38ku（图7A）。纯化的重组蛋白经SDS-PAGE检测为相对单一的38ku电泳条带（图7B）。

图7重组菌表达蛋白TgSUB3(A）及其纯化产物的SDS-PAGE分析

M蛋白分子质量标准1 pET30a-SUB3-KB/BL21(DE3)pLysS未诱导对照2、3 pET30a-SUB3-KB/BL21(DE3)pLysS IPTG诱导6h 4 5倍稀释的纯化蛋白5 10倍稀释的纯化蛋白

3 TgSUB3抗血清制备及效价测定

用纯化的TgSUB3重组表达蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔源多抗。ELISA检测显示兔抗血清效价为1∶102 400（图8）。

图8 ELISA检测兔源TgSUB3抗血清效价

4 TgSUB3多抗纯化及分析

纯化TgSUB3多抗，SDS-PAGE显示纯化蛋白为55ku的单一蛋白条带（图9A）。ELISA检测纯化蛋白的抗体滴度为1∶102 400（图9B）。多抗纯度和滴度均符合要求。

图9 TgSUB3多克隆抗体纯度（A）及滴度（B）测定

3、讨论

对TgSUB3的同源蛋白TgSUB1和TgSUB2的研究表明，TgSUB1基因ORF全长2 388bp、编码795个氨基酸，有信号肽无跨膜区，催化三联体位于Asp259、His315、和Ser490。TgSUB2基因ORF全长3 903bp、编码1 300个氨基酸，包含信号肽和跨膜区，催化三联体位于Glu783、His836、和Ser999[16]。本研究对TgSUB3进行的生物信息学分析显示，该蛋白包含969个氨基酸，有跨膜区无信号肽。TgSUB3同样具有SUB蛋白保守的催化三联体，位于Asp366、His422和Ser583。

蛋白经典分泌途径是指含前导序列（信号肽）的分泌蛋白经过内质网-高尔基体内膜运输系统完成的分泌过程。非经典蛋白质输出/分泌（unconventional protein export/secretion,UPE/UPS）利用不依赖内质网-高尔基体系统的多种方式释放无前导序列（在某些情况下也包括含有前导序列的膜蛋白）蛋白分泌到细胞外[17]。TgSUB1和TgSUB2序列均包含信号肽，为经典的分泌蛋白。本研究预测TgSUB3无信号肽，该蛋白为非分泌蛋白还是非经典的分泌蛋白，以及该蛋白的功能，均需要进一步实验验证。

根据文献报道[16,18],TgSUB1和TgSUB2可分别对弓形虫微线体蛋白（TgM2AP-MIC2复合物和TgMIC4）和棒状体蛋白TgROP1进行酶解加工，从而参与虫体入侵宿主细胞过程。亚细胞定位研究表明，TgSUB1定位于弓形虫微线体，TgSUB2与TgROP1共定位于棒状体。但关于TgSUB3的定位尚不清楚。

多克隆抗体在蛋白定位及功能研究中是一种重要的实验材料。本研究在筛选TgSUB3的B细胞抗原表位的基础上制备了针对该蛋白的兔抗血清，并通过Protein A进行纯化，获得了高纯度、高滴度的TgSUB3多抗，为TgSUB3的定位及功能研究奠定了基础。

参考文献:

[14]魏冬冬,王龙江,李瑾,等.弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备､纯化及其在亚细胞定位中的应用[J].中国血吸虫病防治杂志,2018,30(4):440-442.

[16]郑斌,尹志奎.刚地弓形虫类枯草杆菌蛋白酶的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2014,30(1):93-97.

基金资助:山东省自然科学基金项目(No.ZR2022MH271);山东省医药卫生科技项目(No.202301011242);山东省医药卫生科技发展计划项目(No.202101050153);

文章来源:李瑾,张欣,雷战,等.基于生物信息学分析的弓形虫TgSUB3多抗制备[J].中国病原生物学杂志,2024,19(06):690-694.