心力衰竭是一种以典型症状，如呼吸困难、踝关节肿胀和疲劳为特征的临床综合征，可伴有心脏结构和(或)功能异常引起的体征(如颈静脉压升高等),在休息或应激时导致心排出量减少和(或)心内压力升高[1]。心力衰竭是一个全球性问题，估计影响着全世界超过6 400万人，这个数字随着人口老龄化加剧和急性心血管事件治疗方式的改进而增加[2]。据《中国心血管健康与基本报告2020概要》公布的数据，心血管疾病死亡占我国城乡居民总死亡原因的首位，其中心力衰竭患者数达到890万[3]。心力衰竭的发病机制多样复杂，异常的心肌细胞钙循环是心力衰竭发生的主要病理生理变化之一。钙循环的改变是心肌收缩功能障碍和心律失常发生的主要原因。心功能障碍与钙循环蛋白、钙通道和钙泵的变化密切相关。因此，深入理解钙循环蛋白和心力衰竭的关系对于心力衰竭治疗和预后的研究具有重要意义。本文就关键的几种钙循环蛋白的结构功能及其与心力衰竭治疗的关系做一阐述，为心力衰竭的治疗及预后提供新思路。

1、正常心肌细胞的钙循环

钙循环是细胞内钙的释放和再摄取，驱动肌肉收缩和放松。在心肌细胞中，钙的关键作用是传导信号，作为第二信使，其参与了心肌细胞分裂、分化、DNA复制、基因转录翻译、蛋白磷酸化、细胞凋亡到肌肉收缩。正常生理情况下，在心肌细胞膜去极化时激活细胞膜上的2种钙通道：电压依赖及受体操纵性(机制尚不清楚)、电压依赖性钙通道(L型和T型),2种均参与心脏自动节律的产生。当阈电位达-40 mV时，L型钙通道(LTCC)开放，产生少量钙内流，激活并触发肌浆网(SR)上的兰尼碱受体(RyR2),使SR以最大速度释放出大量的钙，细胞质中游离的钙骤升100倍，游离的钙与肌丝上的肌钙蛋白C形成复合物，进而激活心脏肌肉收缩。随后SR上的肌质网钙-腺苷三磷酸(ATP)酶(SERCA2a)对细胞质中的游离钙(80%)迅速摄取至SR内储存，通道很快关闭，另外20%的游离钙则经钠-钙交换体(NCX)排到细胞外，钙与肌钙蛋白C分离而导致心脏肌肉放松[4]。当心力衰竭发生时，钙循环紊乱对心脏功能有直接影响，任何调控钙循环的蛋白出现异常表达和(或)功能受限都将导致收缩性受损和致命的心律失常，其中的蛋白包括SERCA2a、RyR2、S100A1、受磷蛋白(PLB)、富含组氨酸的钙结合蛋白(HRC)、蛋白激酶A(PKA)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等。

2、钙循环蛋白与心力衰竭

2.1 SERCA2a

哺乳动物SR SERCA蛋白家族根据基因结构编码不同分为SERCA1型、SERCA2型和SERCA3 型，每种类型将根据不同的组织剪切及转录方式产生6种蛋白质。SERCA1型蛋白主要在骨骼肌中表达，SERCA3型蛋白主要在上皮内皮系统表达。SERCA2型蛋白分为2个亚型：SERCA2a和SERCA2b, 二者的区别在于不同的羟基末端，二者前21个外显子相同。SERCA2型蛋白保留22、23、24外显子则形成SERCA2b, 剪切3个外显子则形成1个约110×103的跨膜蛋白SERCA2a。SERCA2型蛋白主要在心脏、平滑肌和Ⅰ型骨骼肌中表达，是其他组织的10～50倍，是钙循环的主要调节因子。SERCA2a是一种离子激活性ATP酶，当细胞内钙浓度大于10-7 mol/L时，SERCA2a被激活，消耗ATP逆浓度梯度将钙由胞浆泵入SR,水解1分子ATP转运2个钙；而当钙顺浓度流入胞浆时，可利用钙流动时释放的能量合成ATP[5]。SERCA2a是心脏中SERCA蛋白的主要亚型，是SR中含量最丰富的蛋白，其有2种结构，即E1(钙亲和力高)和E2(钙亲和力低)。心肌收缩后，肌丝上的肌钙蛋白将钙释放到胞质内，随后与SERCA2a的E1态结合，ATP使E1发生磷酸化后变为E2态，E2结构体失去腺苷二磷酸(ADP)的敏感性，使心肌细胞放松，从而维持细胞内钙稳态。由于E2对钙的亲和力低，钙与E2解偶联后被释放到细胞质中，SERCA2a结构E2转化为E1,重新进入下一个循环[6]。当心力衰竭发生时，SERCA2a的活性和功能受损。一方面，SERCA2a活性的下降导致SR钙含量减少，因此SR中钙离子的释放量减少而出现收缩功能障碍；另一方面，SERCA2a活性的丧失也降低了钙从胞质中去除的数量和速率，在某种程度上抑制了心肌的舒张而出现舒张功能障碍[7]。虽然有研究未发现心力衰竭心肌细胞SERCA2a表达的变化，但有研究表明，在心力衰竭动物模型中，心肌SERCA2a(mRNA和蛋白)的表达均减少，生物活性降低，且与心力衰竭的严重程度呈正相关[8]。家兔心力衰竭早期增加SERCA2a的表达可能有利于心肌收缩和舒张功能的保持[9]。心力衰竭患者中，SERCA2a的表达明显减少，SERCA2a的异常表达可被作为心功能障碍的标志。最近有研究表明，血浆SERCA2a水平是心脏移植排斥反应的独立预测生物标志物，且可经外周血采集通过酶联免疫吸附试验检测[10]。SERCA2a在心力衰竭中的作用已经在动物模型和人类中得到了广泛的研究，其含量和活性受多种因素调控，包括CaMKⅡ直接调控、PLB间接调控、翻译后修饰、激素、miRNA和转录因子等。因此，SERCA2a是与心功能相关的最重要靶蛋白之一。

2.2 PLB

PLB是以五聚体形式在心肌细胞中表达，是SERCA2a的重要调控蛋白之一。PLB的相对分子质量为25×103～27×103,是由52个氨基酸残基组成的单跨膜蛋白，其二、三级蛋白质结构分为2个主要区域：亲水区和疏水区。PLB的3个作用位点[丝氨酸-10(Ser-10)、苏氨酸-17(Thr-17)、丝氨酸-16(Ser-16)]可被磷酸化，而PLB出现去磷酸化将对SERCA2a的功能有抑制作用。有实验表明，SERCA的AA336-412和AA467-762两部分可与PLB的AA2-18部分相互作用以致SERCA的作用发生改变，因此，PLB的亲水区域对SERCA2a的调节起着关键作用[11]。PLB作为一种可被磷酸化的蛋白，主要是通过调节自身磷酸化和去磷酸化来调控SERCA2a的生理活性[12]。有研究表明，调节SERCA2a功能起主要作用的磷酸位点是PLB的Ser-16和潜在的Thr-17,前者更重要。SERCA2a与去磷酸化的PLB结合成复合物可抑制其与钙的亲和力，使SERCA2a的活性降低。SERCA2a与磷酸化的PLB解离后，SERCA2a的抑制作用消失。当动物出现心力衰竭时，PLB/SERCA2a比值上升，以致SERCA2a减弱了对钙的回摄功能，即减弱了心肌收缩力；同时在心力衰竭动物模型中，PLB磷酸化水平降低。因此，PLB与SERCA2a的比值和PLB的磷酸化状态是SERCA2a活性、心脏功能、心脏储备的关键决定因素[13]。有实验表明，SERCA2a的表达和PLB的磷酸化减少时，SR钙摄取减少，PLB mRNA及蛋白水平降低，钙泵功能下降，从而损害心脏的收缩功能[14]。相反，也有研究显示，心肌梗死后大鼠出现心力衰竭时，PLB蛋白和mRNA水平是增高的[15]。在大型哺乳动物(兔)过表达PLB时，SR的转运无明显变化，这些结果表明，SERCA2a受PLB的调控存在重要的物种依赖差异。PLB是SERCA2a唯一直接参与心脏疾病(包括心力衰竭)发展的钙调节蛋白，很可能被认为是心脏疾病检测的一个早期标志物。

2.3 CaMKⅡ

CaMKⅡ是一种分布广泛的多功能丝氨酸-苏氨酸激酶，在哺乳动物中因基因编码不同分为α、β、γ 和 δ 4种亚基，在心肌中表达的主要成分为δ亚基。CaMKⅡδ又分为CaMKⅡδB、CaMKⅡδC 2种亚型，其中CaMKⅡδB亚型主要参与钙动力学调控及电压门控离子通道等兴奋收缩偶联过程，而CaMKⅡδC亚型主要参与钙依赖的信号传导途径。CaMKⅡ的全酶是由8～12个亚基组成的同工酶家族，每个亚基包含3个结构域：C端的结合域、中间调节域及N端催化域。生理状态下，CaMKⅡ调节域的假底物区与催化域结合，阻止催化域与底物蛋白和镁离子/ATP结合，使CaMKⅡ处于自身抑制无活化状态；当收缩期胞内钙浓度增加时，促使大量钙与钙调蛋白结合形成复合物，结合到CaMKⅡ的调节域上，引起CaMKⅡ发生构象改变，调节域解除催化域的自动抑制作用，假底物区释放催化域发挥生理作用，CaMKⅡ全酶被激活，细胞中的靶蛋白(RyR2、PLB、SERCA和LTCC等)依次被磷酸化而发挥生物学功能。当舒张期胞内钙浓度减少时，催化结构域与自身抑制区结合，使激酶构象处于无活化抑制状态，阻止镁离子/ATP与底物蛋白二者结合到酶催化中心。这就是最先发现的CaMKⅡ经典激活方式——钙-钙调蛋白依赖性活化；此外，非钙-钙调蛋白依赖的自身磷酸化方式有氧化、糖基化、S-亚硝基化、磷酸化等，其中很多在糖尿病的环境中表现得越来越突出。CaMKⅡ活性在心脏疾病早期即可升高，而CaMKⅡ表达在晚期或终末期心力衰竭患者中显著升高。心力衰竭小鼠CaMKⅡδC亚型的蛋白表达、磷酸化、mRNA水平均增加，同时该研究还在CaMKⅡδC亚型的转基因小鼠中发现CaMKⅡδC亚型活性增高了1.7～3.0倍，并且大部分小鼠出现心力衰竭的症状(肺淤血等),最后出现了心脏扩大、心室功能障碍，甚至死亡[16]。有研究观察到过表达CaMKⅡ后可调节兴奋-收缩偶联，导致SR钙渗漏增加、NCX表达增加、SR钙含量减少及SERCA2a蛋白表达降低，使小鼠心肌细胞收缩功能下降，最终造成心力衰竭[17]。当发生结构性心脏病时，SERCA2a/PLB、LTCC及RyR2因过度激活的CaMKⅡ出现高度磷酸化，从而使心脏功能受影响。在不同的心肌应激状态和不同的心脏疾病中，CaMKⅡ的过表达和活性增加；心力衰竭小鼠出现SR钙回摄下降，钙渗漏增加，CaMKⅡ蛋白表达水平和活性均增加。CaMKⅡ转基因小鼠发生心力衰竭，而CaMKⅡ基因抑制或转基因CaMKⅡ敲除可恢复心脏功能并免受心肌纤维化的影响[18]。在使用动物模型和心力衰竭患者心肌细胞的实验中，已经观察到CaMKⅡ抑制的有益作用，表明CaMKⅡ在心力衰竭和心律失常的发生、发展方面起着关键作用。

2.4 HRC

HRC是SR摄取、储存和释放钙的新型调节剂。HRC基因在人类中位于19q13.3,由6个外显子组成，90%的编码区位于第1个外显子，该基因的转录具有组织特异性。在224处有一个GGCTGGGG序列，其也存在于SERCA酶基因1和SERCA酶基因2的上游，可作为SR信号。HRC是一种低亲和力、高容量的钙结合蛋白，具有很强的结合钙的能力，其主要在横纹肌和小动脉平滑肌中高表达，相对分子质量为170×103。HRC已被证明通过连接素与SERCA2a和RyR2相互作用，表明其在SR钙储存和释放之间的相互作用中可能发挥重要作用。因此，当钙负荷降低时，HRC与SERCA2相互作用，影响SERCA2活性；当HRC中的钙饱和时，其会从SERCA2解离，并增加与位点的结合，进一步调节钙的释放。成年大鼠和新生小鼠心肌细胞HRC过表达均增加了SR钙负荷，但细胞释放钙减少；在异丙肾上腺素诱导下，体外过表达HRC使心肌细胞收缩力和钙动力受损。过表达HRC可能损害心功能，但也有研究发现，其在体内和体外对缺血应激有保护作用，与心肌再灌注后梗死面积缩小及改善心肌收缩功能相关。由于减弱SR钙的摄取，减少钙的释放及减轻线粒体钙负荷，可以通过减少细胞凋亡和坏死实现这种心脏保护，以对抗缺血/再灌注引起的心脏损伤。在有或没有主动脉缩窄(TAC)诱导的心力衰竭小鼠中，体内腺相关病毒(AAV)介导的HRC敲除与对照组相比，其射血分数减少和心肌纤维化增加，因此，在TAC诱导的心力衰竭后，HRC下调导致心功能显著恶化[19]。细胞培养中，HRC Ser96Ala的急性过表达显著增加了HRC Ser96Ala与SERCA2的结合，这种影响与SERCA2活性的抑制增强有关，从而降低SR的最大钙摄取速率[20]。在对HRC过表达小鼠的研究中，HRC与SERCA的比值可能对SERCA功能很重要。发生心力衰竭时，HRC与SERCA的比值增加，可能解释了HRC转基因小鼠抑制钙循环的原因。HRC具有潜在的双重调控，阐明HRC与SERCA的相互作用将有助于临床理解HRC在生理和病理条件下调节SR钙摄取和释放的机制。

2.5 S100A1

S100蛋白首先在牛的体内发现，是一种高酸性钙集合蛋白家族，其中一些蛋白在心脏组织中高度表达，一些特定的S100蛋白受损与心力衰竭有关。S100蛋白通过控制钙内流调节生物细胞学效应，如程序性细胞死亡、细胞收缩、基因表达。在心肌中，S100A1蛋白是S100家族的主要成员，相对分子质量为10×103;其属于EF手型钙结合蛋白，有2个EF手型结构，此结构包括1个羧基末端和1个氨基末端，二者均含有疏水区，其中钙的结合位点位于羧基末端。当EF手型结构与钙结合后，S100A1蛋白的构象发生改变，暴露出疏水区(靶蛋白结合位点),从而与相应的靶蛋白结合发挥其生物学作用。S100A1蛋白主要在人心肌细胞中表达(左心室为主),定位于心肌亚细胞内，其是心肌细胞内钙结合的主要蛋白，通过调节肌质网、线粒体、肌节功能而改善心功能。S100A1已被证明与心脏SR中的SERCA2a和RyR2相互作用，从而分别促进收缩期钙释放和舒张期钙的再摄取。S100A1与SR钙泵/PLB复合物以钙依赖的方式而相互结合作用，使SERCA2的活性提高，进而SR钙摄取增加。肌丝中的S100A1蛋白促进舒张期钙的解离来调节舒张期心肌的僵硬度。正常心功能至少需要50%的S100A1蛋白来维持。大量研究证实，S100A1的mRNA及其蛋白的表达水平在心力衰竭中均显著下降，且心力衰竭越严重，下降幅度越大。在终末期心力衰竭患者的心肌组织中，S100A1蛋白水平下降，并且S100A1蛋白的缺乏会加速实验室动物的心力衰竭[21]。最近研究通过永久性结扎冠状动脉左前降支建立大鼠心力衰竭模型，发现心肌组织中的S100A1蛋白显著下调；而单敲除S100A1却显著增加了大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡水平和心肌纤维化程度[22]。某些S100蛋白也存在于病理过程中的血清和其他生物液体中，并被用作疾病标志物：血浆S100A1水平升高是ST段抬高型心肌梗死的预测因子，而S100A1在衰竭和肥厚性心脏组织中的表达降低[23]。

2.6 PKA

蛋白激酶在细胞生物学和生理学的每个方面都起着重要的作用，因此其功能障碍往往与疾病有关。第1次发现于1968年的3,5-环磷酸腺苷(cAMP)依赖性PKA被认为是所有蛋白激酶的原型，在所有哺乳动物细胞类型中都有表达，这种激酶与心力衰竭和其他心脏疾病的进展密切相关。PKA是一种由cAMP激活的丝氨酸/苏氨酸激酶，其由2个调节亚基(R)和2个催化亚基(C)组成，调节亚基有4种亚型(RⅠα、RⅠβ、RⅡα、RⅡβ),催化亚基有3种亚型(Cα、Cβ、Cγ),每一种亚型都有不同的组织表达和亚细胞定位模式。在没有cAMP的情况下，PKA四聚体(R2C2)保持其无活性状态；然而，在cAMP存在的情况下，2个调节亚基与cAMP结合，催化亚基从全酶中释放，产生具有酶活性的调节亚基与cAMP的复合物(R-cAMP)。PKA 通过调节心肌细胞中的钙动力学来调节心肌收缩、舒张和心率。心肌PKA可以通过经典和非经典途径激活。非经典途径以不依赖cAMP的方式促进PKA激活。在典型的PKA途径中，在压力或应激反应中，快速释放的儿茶酚胺对SR的β-肾上腺素受体的刺激诱导cAMP依赖性PKA活化，从而磷酸化参与调控收缩/松弛的靶蛋白，包括RyR2、PLB和SERCA[24]。PKA在心脏功能调节中发挥多种作用，包括收缩、代谢、离子通道和基因转录。PKA活性改变可能会导致进展为心肌病和心力衰竭。PKA增加钙电流、SR钙摄取和释放、SR钙含量，以及钙从肌丝分离，通过这些和其他相关底物的磷酸化促进心脏的收缩和舒张。据报道，在心力衰竭中，由于PKA的改变导致钙通量和钙利用率的失调[25]。有研究已表明，与未衰竭的心脏相比，心力衰竭中PKA的活性和蛋白质水平显著增加[26],但也有相反的报道[25]。PKA是健康和疾病中心脏功能的关键调节剂。尽管关于PKA在心肌病发展中确切作用的文献存在不一致结论，但大多数研究结果显示，PKA抑制是治疗心脏肥大、心脏扩张、缺血再灌注、心肌梗死和心力衰竭的潜在靶标。然而，绝大多数研究是在分离的心肌细胞或其他体外环境下进行的。因此，需要在小型和大型动物模型中验证这些研究的结果，最终通过临床试验进一步验证PKA抑制剂在人类心脏疾病中的作用。

3、心力衰竭的治疗现状

尽管几乎所有心脏疾病的治疗都取得了重大进展，但心力衰竭是一个例外，仅仅出现了很小的生存率升高，而心力衰竭反复住院率仍未明显下降，因此，迫切需要新的治疗方案。在细胞分子水平上了解心脏病，并确定发病过程中受影响的关键转运蛋白和蛋白质，成为治疗心脏疾病的新策略。SERCA2a无疑发挥着核心作用，恢复心脏SERCA2a的表达和改善心肌细胞钙处理为目前使用移植和机械辅助装置治疗心力衰竭提供了一个很好的替代方案。治疗心力衰竭的中药和化学合成药物都以直接或间接调控钙蛋白表达或活性的途径改善心功能。目前，治疗心力衰竭的一项新策略是通过转基因上调SERCA2a表达或提高其活性，多采用AAV载体介导转基因表达，一系列动物模型、啮齿类动物模型和大型动脉模型均显示，通过病毒载体将SERCA2a基因导入病毒心肌细胞可改善收缩和舒张期效应[27]。2007年，美国临床上进行了第一期心力衰竭转基因治疗，直接对晚期心力衰竭患者冠状动脉内注射不同剂量的AAV1-SERCA2a基因用以评价其有效性和安全性，研究发现在高剂量AAV1-SERCA2a组中，6 min步行距离和心功能明显改善。随访3年后主要心血管不良事件(心肌梗死复发、心力衰竭恶化和再次住院)有所减少。但在2012年进行的大样本研究中，主要终点事件有所改善，次要终点事件未发现受益，但该研究至少证实了SERCA2a基因治疗是安全的[28,29]。也有研究发现，通过基因转染方法上调SERCA2a的表达使心脏收缩功能增强，但同时增加了心肌梗死急性期心律失常发生率、死亡率，势必限制临床应用；相反，上调S100A1的表达不仅能使心脏的舒缩功能得到改善和心力衰竭的发展延缓，而且心律失常的发生率不会增加，与其他治疗方法比较有明显的优势。有2项不同研究证实了S100A1基因治疗在动物模型上治疗心力衰竭的有效性，但只有一项关于治疗靶点的研究在体外进行，也证实了通过靶基因治疗使衰竭心肌细胞中S100A1增加，从而达到改善心力衰竭的疗效[30],但这还需要更进一步的大规模临床试验。目前的治疗主要针对增加SR钙摄取和防止钙渗漏，许多研究目前正在动物模型或心力衰竭患者中进行评估。有一些疗法在显示出早期成功迹象后，在评估阶段取得了进展(SERCA2a),而其他疗法则处于开发早期(S100A1)。虽然运用至临床仍然需要解决很多问题，但强调SR钙循环蛋白将为未来心力衰竭的新治疗方案铺平道路，该方案将有很好的临床应用前景。综上所述，钙循环蛋白表达或功能异常对细胞内钙循环有直接影响，通过干预钙循环蛋白的表达，以及药物和基因治疗等改变钙循环蛋白的含量或活性都将成为治疗心力衰竭的新靶点，希望这种方法能够减缓心力衰竭进展、改善患者生活质量和降低死亡率。

基金资助:苏州市卫生青年骨干全国导师制培训项目(H190426);湖北科技学院医学部教研项目(2023YJDJY010);

文章来源:刘兰,邹操.心力衰竭与钙循环蛋白关系的研究进展[J].现代医药卫生,2024,40(13):2287-2292.