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动物源细菌耐药性检测实验室质量控制要求

2024-08-18 42 上传者：管理员

摘要：随着抗菌药物种类增多和抗生素处方数量的增加，广泛的抗菌素耐药性传播成了一个日益严重的卫生保健问题，对细菌感染的有效治疗带来巨大挑战。目前，对于耐药性检测结果的准确性判断控制的研究相对较少。本文从人员、设施与环境、设备和试剂、样本采集及运送、检验过程和检验后过程6个方面，对动物源细菌耐药性检测实验室需要注意的质量控制问题进行了详细的讲解，不仅保证了实验达到生物安全的要求，同时也保证了实验数据的真实可靠。为不同实验室间实验过程的准确度、试剂的可靠性和操作的正确性提供了指导方向，为后续的数据统计分析提供了准确、合理、规范的基础数据，进而能够真实反映耐药性现状的要求。

关键词：
动物源
卫生保健问题
抗菌药物种类
耐药性
质量控制
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为了提高动物源细菌耐药性检测实验室（以下简称“实验室”）质量控制能力，我们以《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》《检验检测机构资质认定评审准则》《农业部产品质量监督检验测试机构基本条件》为基本原则，结合世界各国先进管理经验，从实验室角度对该过程相关因子的真实性和准确性制定规范准则。该规范准则涵盖了实验的全过程，包括前期、中期和后期，以及动态影响因子（人员和环境）和静态影响因子（设备、设施和方法学）。

1、人员

从事耐药性检测的人员应满足《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》中“6.2人员”、《检验检测机构资质认定评审准则》中第九条、《农业部产品质量监督检验测试机构基本条件》中“第二章机构与人员”的相关要求。耐药性检测负责人还应具有独立签发药物敏感性检验报告的能力。耐药性检测人员应具备微生物检验、生物安全相关理论知识和实践经验，能够正确使用耐药监测系统完成数据上报，并具有对耐药性监测数据进行分析总结的能力。耐药性检测人员应相对固定，数量可以满足工作需要。新员工或长时间不从事该方面检验人员应经相应岗位能力评估合格后方可独立操作。检测人员每年需参加专业学习，包括自行组织学习、线上学习、外出学习等形式。

2、设施与环境

2.1 设计原则

实验室设计参照GB 50346—2011《生物安全实验室建筑技术规范》、GB 19489—2008《实验室生物安全通用要求》、NY/T 1948—2010《兽医实验室生物安全要求通则》和WHO《实验室生物安全手册》，遵循科学的设计理念，合理选址、规范布局、流程通畅、设计先进。

实验室设计要符合生物安全法的理念，保证生物安全性，确保实验室人员及环境的安全；要结合现有条件合理规划，既保证功能齐全达到检测要求，又能经济实用营造舒适的检测环境；要有适当超前原则，在空间上留有发展余地；布局上要体现出专业特征，便于控制、操作和管理。

2.2 布局

实验室可采用常压和负压两种状态的实验室。常压状态实验室主要用于培养基制备、生化鉴定、血清分型及药敏试验和湿热干热灭菌消毒等；负压状态实验室的生物安全防护性能高于常压状态实验室，其主要用于细菌的分离纯化、无菌实验、真菌检测等。

2.3 设施

实验室可以设置在共用建筑物内，但应相对独立。入口处应有对应等级的生物安全黄色警告防护标识、标明负责人、联系电话等。实验室内部布局应满足微生物实验室基本要求，配备实验操作区域、人员缓冲区域和物品清洁区域；物流、人流不应出现重叠；操作间的门应配有玻璃窗，并且门能够自动感应；大门需配有门禁卡。

实验室内部空气流通可以使用自然风，同时配备防蚊虫纱窗。当使用器械人工通风时，通风系统应独立于公共的中央空调系统，以防污染。采用内部循环排风系统的生物安全柜，实验室应配备通风换气装置；采用管道排风式生物安全柜，实验室的排风系统要求独立安装，不应与公共通风系统相连。另外，根据实验操作时的标准操作规程和仪器管理办法，实验室内必须配备足够数量的洗手池。洗手池要位于实验操作区域出口处，并配有脚踏式、长手柄式或自动感应式洗手龙头，同时配备消毒设施，包括洗手液、消毒皂液、新洁尔灭等，特殊时期配备快速手部消毒液。另外，耐药性检测实验操作区内应安装足够数量的洗眼设备，重点区域配备应急喷淋装置。

3、设备和试剂

3.1 设备

实验室应配备的设备包括：二级生物安全柜、恒温培养箱、低温冰箱、超低温冰箱、光学显微镜、比浊仪、高压灭菌器、细菌鉴定仪、菌液接种仪、定量PCR仪、基质辅助激光解吸电离-微生物质谱、细菌药敏结果分析仪等。各种设备应定期做好验证、检定或校准，做好维护和使用记录；对于温度依赖的仪器，要做好温度监控记录；对于压力容器要每个灭菌包外贴化学指示胶带，定期进行生物监测。

3.2 试剂

实验室应配备的试剂包括：在细菌分离及鉴定过程中涉及的培养基，药敏实验的菌株等。购买的培养基、试剂及试剂盒要按照GB 4789.28—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》、SN/T 1538.1—2016《培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则》和SN/T 1538.2—2016《培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南》要求进行验证，验证后分类存储，并建立清单。培养基的配制和使用应及时进行记录。对使用中的试剂制定管理办法，包括质量控制周期和检测方法。对于染色剂，使用频率高时每周用阳性和阴性质控菌株检测，使用频率低时，每次实验用阳性和阴性质控菌株检测；对于血清试剂，每次实验时做多价血清阳性和阴性质控。

药敏试验应选用标准菌株，确保检测结果的溯源性和稳定性。实验室需要建立完善的记录文件，包括标准菌株台账、标准菌株使用记录、标准菌株传代记录、标准菌株验证记录、标准菌株期间核查、标准菌株销毁记录等。

在菌种保藏和分类鉴定中，要核查菌种质量，如果发现有结团、污染或泄漏要立即重新保存。对菌种的操作要有详细的记录，要做到每一步实验有记录可查。实验室应配备基本的标准菌株，作为标准储备菌株F1代要在-80℃保存，储备菌株F2代在-20℃多管保存，工作菌株F3～F5代在4℃冰箱斜面或平板保存。

4、样本采集及运送

4.1 样本来源的确定

对于弯曲菌属肠球菌属和肠杆菌属，样本主要来自养殖场或屠宰场，对象为鸡或猪的粪便；对于葡萄球菌属，样本只针对生鲜乳；对于宠物源大肠杆菌和肠球菌，样品主要来自动物医院的宠物犬或猫。样本的代表性通过以下方法来得到保证：一个圈舍只收集1株一种菌，一个养殖场的样本分离获得的菌株收集不超过10株，致病菌收集不超过5株。

4.2 采样单填写

详细填写NY/T 4141—2022《动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程》中采样单内容，填写预防用抗生素药的种类与药物使用方式、治疗用抗生素药物的种类与药物使用方式，有特殊情况要详细注明。

4.3 样品的运输

在运输中要选用合适的运送培养基。对于大肠杆菌、肠球菌的拭子使用商业化的运输培养基即可；沙门氏菌的盲肠和金黄色葡萄球菌的生鲜牛乳不需要运送培养基；弯曲菌最好是在采样现场直接涂布到分离培养基中。运输温度尽量保证在4℃左右，24 h内尽快到达实验室，如若无法准时到达，最多延长到72 h。

4.4 样本接收耐药性

实验室对收到的样本要进行手写或电脑登记，主要记录样本接录时间，同时粗略判断样本状态，对于腐烂变质和不符合运输要求的样本不能接收。

5、检验过程

目前，耐药性实验中对抗生素敏感性测试的方法主要有E-test法、肉汤稀释法、琼脂稀释法和纸片扩散法等。在这些方法中，肉汤稀释法的结果综合性评定结果最好，建议实验室以微量肉汤稀释法为主，快速检测时可采用E-test法等。动物源细菌分离纯化及耐药性检测依据NY/T 4149—2022《动物源大肠埃希菌分离与鉴定技术规程》、NY/T 4147—2022《动物源肠球菌分离与鉴定技术规程》、NY/T 4146—2022《动物源沙门氏菌分离与鉴定技术规程》、NY/T 4145—2022《动物源金黄色葡萄球菌分离与鉴定技术规程》、NY/T 4148—2022《动物源弯曲杆菌分离与鉴定技术规程》、NY/T 4142—2022《动物源细菌抗菌药物敏感性测试技术规程微量肉汤稀释法》等标准。每次进行药敏检测时，都需要跟随质控菌株重复3～4次，保证结果的可靠性。

实验室应制定人员比对质量控制程序，由多名技术人员进行专业性强检验项目的考核和比较，定期对工作人员技能素质进行验证，保证检验结果的一致性和准确性，同时还要参加实验室间比对。参加实验室间比对和能力验证不仅是对实验室检测能力和分析能力的评判，也是对实验室质量控制效果的考察，更是发现系统误差和标准化实验室的比对。通过参加能力验证活动，证实实验室对耐药性监测程序和方法的有效控制，提高实验室可信度，完善实验室质量管理体系。同时参加实验室间比对可确定各实验室进行某些项目检测的能力，以及检测实验室耐药性监测的持续能力，有利于实验室技术水平的提高。耐药性实验室应对能力验证或者不同耐药性实验室之间质量评估的原始记录、结果和证书要实时留存，为实验室能力体现提供证明。

6、检验后过程

实验室应制定合理和完善的卫生管理制度、废弃物管理制度、菌种保藏制度、数据结果上报制度，以确保实验过程符合国家标准的要求规范。检验后的样本、污染培养基等废弃物应采取合理处理，然后投入指定的容器内，经无害化处理后方可废弃，以防对环境和人员造成危害，以及引起病原微生物的传播。分离纯化获得的耐药性菌株应遵照《病原微生物实验室生物安全管理条例》要求，对菌种、菌株、菌粉制定保管要求，并按规定严格实施，控制好菌种、菌株、菌粉。

参考文献:

[1]郭凯旋,王湘如,赵月,等.我国动物源细菌耐药性监测及预警的研究进展[J].中国兽药杂志,2021,55(4):79-85.

[2]生物安全实验室建筑技术规范:GB 50346—2011[S].

[3]实验室生物安全通用要求:GB 19489—2008[S].

文章来源:韩镌竹,李欣南,邱月,等.动物源细菌耐药性检测实验室质量控制要求[J].品牌与标准化,2024,(05):122-124.