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虾青素对2型糖尿病小鼠术后认知功能障碍的影响

2024-06-13 13 上传者：管理员

摘要：目的探讨虾青素对2型糖尿病小鼠术后认知功能障碍(POCD)的改善作用及可能机制。方法雄性C57BL/6J小鼠48只，采用高脂饲料喂养+腹腔注射烟酰胺及链脲佐菌素法制备2型糖尿病模型。36只造模成功小鼠随机分为对照组、模型组、虾青素组各12只，模型组、虾青素组采用七氟醚麻醉下行剖腹探查术制备POCD模型，对照组正常饲养不行剖腹探查术。虾青素组术后腹腔注射虾青素30 mg/(kg•d),对照组、模型组腹腔注射等量生理盐水，共3 d;比较3组小鼠术前体质量、血糖水平及术后游泳速度。造模后采用Morris水迷宫实验评估小鼠术后认知功能(逃避潜伏期、穿越平台次数、目标象限停留时间百分比),采用免疫荧光染色法检测小鼠海马组织离子钙结合衔接分子1(Iba1)相对荧光强度及A1型星形胶质细胞百分比，采用ELISA法检测小鼠海马组织肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1α、补体1q(C1q)水平，采用Western blot法检测小鼠海马组织突触后致密蛋白95(PSD95)、突触素(SYP)蛋白相对表达量。结果 3组术前体质量、血糖水平及术后游泳速度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组逃避潜伏期[(34.58±10.54)s]长于对照组[(15.56±5.73)s]、虾青素组[(24.63±7.79)s](P<0.05),穿越平台次数[(2.92±1.08)次]、目标象限停留时间百分比[(29.04±10.30)%]均少于对照组[(6.25±2.09)次、(54.40±10.16)%]、虾青素组[(5.33±1.50)次、(41.04±9.20)%](P<0.05);虾青素组逃避潜伏期长于对照组(P<0.05),目标象限停留时间百分比少于对照组(P<0.05),穿越平台次数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组海马组织Iba1相对荧光强度[(7 951.09±1 818.78)AU]、A1型星形胶质细胞百分比[(50.93±8.84)%]及TNF-α[(59.27±21.44)pg/mg prot]、IL-1α[(22.94±6.81)pg/mg prot]、C1q[(9.35±3.62)pg/mg prot]水平均高于对照组[(3 038.24±301.92)AU、(18.72±3.06)%、(20.26±6.86)pg/mg prot、(7.96±1.71)pg/mg prot、(3.83±1.13)pg/mg prot]、虾青素组[(4 345.32±989.66)AU、(25.23±7.48)%、(35.17±12.16)pg/mg prot、(15.36±4.22)pg/mg prot、(5.79±1.61)pg/mg prot](P<0.05),PSD95、SYP蛋白相对表达量(0.42±0.17、0.64±0.18)均低于对照组(1.00±0.22、1.00±0.13)、虾青素组(0.80±0.21、0.91±0.15)(P<0.05);虾青素组海马组织IL-1α水平高于对照组(P<0.05),Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比，TNF-α、C1q水平及PSD95、SYP蛋白相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论虾青素可改善2型糖尿病小鼠POCD,可能与虾青素抑制海马小胶质细胞激活及其介导的炎性反应，减少A1型星形胶质细胞极化，从而上调突触数量有关。

关键词：
2型糖尿病
A1型星形胶质细胞
术后认知功能障碍
突触
虾青素
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术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是以学习和记忆等功能障碍为主要特征的术后并发症，可导致患者住院时间延长、生活质量下降[1]。糖尿病发病率逐年升高并趋于年轻化，糖尿病患者POCD发生率明显增高[2,3]。虾青素是一种类胡萝卜素，可从藻类、蟹、鱼和虾中提取，已被批准为一种安全的食品添加剂[4]。腹腔注射虾青素可减轻血管性痴呆小鼠认知功能障碍[5]。本研究探讨虾青素对2型糖尿病小鼠POCD的改善作用及可能机制，报道如下。

1、材料与方法

1.1一般材料

SPF级雄性C57BL/6J小鼠48只，4周龄，体质量约16 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物许可证号：SCXK(鄂)2022-0030]。小鼠饲养于22℃,湿度50%环境中，昼夜循环光照，自由摄食饮水，适应性饲养1周后进行实验。本研究经武汉大学人民医院实验动物伦理委员会批准通过(伦理批准号：WDRM202201203)。

1.2方法

1.2.1 2型糖尿病小鼠模型制备

依据文献[6]制备2型糖尿病模型。小鼠给予60%高脂饲料喂养4周后禁食16 h,然后腹腔注射240 mg/kg烟酰胺(北京索莱宝科技有限公司),间隔15 min后腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素(北京索莱宝科技有限公司),连续注射3 d。最后1次注射后72 h检测小鼠空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L为2型糖尿病模型制备成功。本实验48只小鼠中造模成功36只。

1.2.2 POCD模型建立及分组

36只小鼠随机分为对照组、模型组、虾青素组各12只，模型组、虾青素组依据文献[7]制备2型糖尿病POCD模型：采用体积分数5%七氟醚麻醉诱导3 min,随后体积分数2.0%七氟醚维持麻醉，腹部剃毛并消毒铺巾后，在右肋缘下0.5 cm处经皮肤作1.5 cm切口，依次探查腹腔脏器(肝、脾、肾、肠)后，从腹腔中取出一段10 cm小肠，食指和拇指用力揉搓30 s后将其放回，4-0缝合线逐层关闭伤口，术毕停止七氟醚麻醉，总时间30 min。每8 h伤口涂抹利多卡因乳膏减轻小鼠切口痛，共3 d。对照组小鼠正常饲养不行剖腹探查术。虾青素组小鼠术后注射虾青素30 mg/(kg·d)[8],对照组、模型组小鼠术后腹腔注射等量生理盐水，共3 d。

1.2.3小鼠认知功能评估

采用Morris水迷宫实验评估小鼠认知功能。3组小鼠于造模前5 d开始训练，Morris水迷宫等分为东、西、南、北4个象限，将平台置于东象限水下1 cm正中位置，小鼠面向池壁放入Morris水迷宫中，记录登陆到平台的时间(即逃避潜伏期，如超过60 s仍无法登陆平台记为60 s,引导小鼠至平台停留15 s),每天完成4个象限的训练，共5 d。造模后第3天行定位航行测试：将小鼠随机放入4个象限，记录小鼠游泳速度及逃避潜伏期。造模后第4天行空间探索测试：撤掉平台后记录小鼠60 s内穿越平台所在位置的次数(穿越平台次数)及在东象限的停留时间百分比(目标象限停留时间百分比)。

1.2.4小鼠海马组织A1型星形胶质细胞百分比及离子钙结合衔接分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1, Iba1)相对荧光强度检测

采用免疫荧光染色法。七氟醚麻醉下将小鼠固定于操作台，暴露心脏，左心室插入灌流针并剪开右心耳，首先使用预冷PBS灌流，待右心耳流出清亮液体后灌入预冷体积分数4%多聚甲醛。剥开颅骨取出全脑，分离海马组织，体积分数4%多聚甲醛固定24 h,质量分数30%蔗糖溶液脱水后切片(厚度30μm),PBS洗涤3次，8 min/次；体积分数10%山羊血清封闭1 h;加入Iba1(1:200)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)(1:500)、补体C3(complement 3, C3)(1:200)(英国Abcam公司)一抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，8 min/次；孵育FITC和Cy3标记的二抗(1:500)1 h及DAPI(均为英国Abcam公司),PBS清洗3次后进行贴片及荧光显微镜拍照。将C3与GFAP共定位细胞定义为A1型星形胶质细胞，计算单位面积内A1型星形胶质细胞数量，采用Image J软件分析Iba1相对荧光强度。

1.2.5小鼠海马组织肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白细胞介素(interleukin, IL)-1α、补体1q(complement 1q, C1q)水平检测

采用ELISA法。将新鲜小鼠海马组织匀浆裂解，4℃,离心半径8 cm, 10 000 r/min离心10 min后取上清液，应用TNF-α、IL-1α、C1q ELISA试剂盒(美国LifeSpan公司)检测TNF-α、IL-1α、C1q水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6小鼠海马组织突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95, PSD95)、突触素(synaptophysin, SYP)蛋白相对表达量检测

采用Western blot法。将小鼠海马组织置于RIPA裂解液并匀浆，12 000×g离心10 min,应用BCA蛋白定量试剂盒(北京普利来基因技术有限公司)检测样本总蛋白浓度。采用5×蛋白上样缓冲液将样本浓度配为40 g/L,行SDS-PAGE电泳分离蛋白并将其转至PVDF膜。体积分数5%胎牛血清室温封闭1 h,滴加PSD95(1∶1 000)、SYP(1∶1 000)(英国Abcam公司)抗体，4℃孵育过夜，PBS洗膜3次；滴加HRP标记的IgG二抗(1∶10 000)(北京普利来基因技术有限公司)室温孵育1 h, PBS洗膜3次。ECL显影，应用Image J软件计算目的蛋白相对表达量。

1.3统计学处理

应用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差

表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 3组术前体质量、血糖水平及术后游泳速度比较

3组术前体质量、血糖水平及术后游泳速度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组术前体质量、血糖水平及术后游泳速度比较

2.2 3组术后认知功能比较

模型组逃避潜伏期长于对照组、虾青素组(P<0.05),穿越平台次数、目标象限停留时间百分比均少于对照组、虾青素组(P<0.05);虾青素组逃避潜伏期长于对照组(P<0.05),目标象限停留时间百分比少于对照组(P<0.05),穿越平台次数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组术后认知功能比较

2.3 3组海马组织Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比及TNF-α、IL-1α、C1q水平比较

模型组海马组织Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比及TNF-α、IL-1α、C1q水平均高于对照组、虾青素组(P<0.05);虾青素组海马组织IL-1α水平高于对照组(P<0.05),Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比及TNF-α、C1q水平与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3,图1-2。

表3 3组海马组织Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比及TNF-α、IL-1α、C1q水平比较

图1 3组小鼠海马组织Iba1免疫荧光染色图(荧光显微镜,×200)

图2 3组小鼠海马组织GFAP和C3免疫荧光染色图(荧光显微镜,×200)

2.4 3组海马组织PSD95、SYP蛋白相对表达量比较

模型组海马组织PSD95、SYP蛋白相对表达量均低于对照组、虾青素组(P<0.05),虾青素组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4,图3。

表4 3组海马组织PSD95、SYP蛋白相对表达量比较

图3 3组小鼠海马组织PSD95、SYP蛋白表达Western blot图

3、讨论

POCD是老年患者围手术期常见中枢神经系统并发症，表现为术后持续数月甚至数年的认知、学习和记忆等功能损伤，严重降低患者生活质量，目前尚无有效治疗方法[9]。糖尿病是POCD的独立危险因素，增加POCD发生率[2]。虾青素可改善阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等中枢神经系统疾病认知功能障碍[10]。但虾青素能否改善2型糖尿病POCD尚不清楚。因此，探讨虾青素在2型糖尿病POCD中的作用及机制，可为POCD的治疗提供实验依据。

Morris水迷宫实验常用于评估啮齿类动物海马依赖的空间学习记忆[11]。本研究结果显示，与对照组相比，模型组术后逃避潜伏期延长、穿越平台次数及目标象限停留时间百分比减少；表明2型糖尿病小鼠术后海马依赖的学习记忆损伤，即2型糖尿病小鼠POCD模型制备成功。与模型组相比，虾青素组术后逃避潜伏期缩短，穿越平台次数及目标象限停留时间百分比增加；表明虾青素可有效改善2型糖尿病小鼠POCD,可能是由于海马炎症是POCD发生的重要因素之一，而虾青素有抑制小胶质细胞激活和抗炎的作用，从而改善POCD[10]。

小胶质细胞是脑内固有免疫细胞，其过度激活及炎性因子释放参与POCD的发生、发展[12]。小胶质细胞激活后通过释放TNF-α、IL-1α、C1q诱导星形胶质细胞向有神经毒性的A1型极化，损伤突触结构和功能，引起认知功能障碍[7,13,14]。Iba1在中枢神经系统的小胶质细胞中特异性表达，是小胶质细胞标志物。GFAP与C3共定位细胞代表A1型星形胶质细胞[13]。A1型星形胶质细胞可导致POCD小鼠海马CA1区兴奋性神经元突触数量减少[7]。本研究结果显示，模型组海马组织Iba1相对荧光强度、A1型星形胶质细胞百分比及TNF-α、IL-1α、C1q水平均高于对照组、虾青素组；表明2型糖尿病POCD小鼠海马组织小胶质细胞激活及TNF-α、IL-1α、C1q水平升高，而虾青素可抑制2型糖尿病POCD小鼠海马小胶质细胞激活，下调TNF-α、IL-1α、C1q表达，降低A1型星形胶质细胞百分比，提示虾青素可抑制小胶质细胞激活及其介导的炎性反应，减少A1型星形胶质细胞极化，上调突触数量，从而改善POCD小鼠认知功能。研究[15]发现，虾青素可通过抗氧化和抗炎等途径发挥作用，抑制脂多糖引起的大鼠海马小胶质细胞激活，从而改善其认知功能障碍。

突触前膜标志物SYP和突触后膜标志物PSD95蛋白表达情况可反映突触数量变化。本研究结果显示，模型组小鼠海马组织SYP、PSD95蛋白相对表达量均低于对照组、虾青素组，表明虾青素可上调2型糖尿病POCD小鼠海马组织SYP、PSD95蛋白表达，虾青素可能通过抑制星形胶质细胞向A1型极化上调海马突触数量。

本研究结果提示，虾青素可改善2型糖尿病小鼠POCD,可能与虾青素抑制海马小胶质细胞激活及其介导的炎性反应，减少A1型星形胶质细胞极化，从而上调突触数量有关。但本研究中仅给予单一剂量(30 mg/kg)虾青素，无法反映虾青素改善2型糖尿病小鼠POCD的量效关系；剖腹探查术中未监测小鼠生命体征，生命体征波动有可能对实验结果产生影响；因此，虾青素对2型糖尿病POCD的改善作用尚需进一步研究证实。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

[1]侯梦园,张加强,温兆宇.蛋白质组学在术后认知功能障碍标志物中应用研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2023,37(10):1073-1076.

[3]成人早发2型糖尿病诊治共识专家组,河南省医学会内分泌学分会,河南省医学会糖尿病学分会.成人早发2型糖尿病诊治专家共识[J].中华实用诊断与治疗杂志,2022,36(12):1189-1198.

[6]罗钢,崔永晨,曹越,等.手术创伤对2型糖尿病小鼠术后认知功能和脑葡萄糖代谢的影响[J].上海交通大学学报(医学版),2020,40(11):1468-1472.

基金资助:国家自然科学基金青年项目(82101253);湖北省自然科学基金面上项目(2022CFB108);武汉市科技局知识创新专项基础研究项目(2022020801010535);吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金(320.6750.2024-11-01);

文章来源:贾一帆,杨帆,陈璟莉,等.虾青素对2型糖尿病小鼠术后认知功能障碍的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(06):541-545.