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肝豆状核变性儿童临床表型与ATP7B基因突变谱变化研究

2024-03-12 32 上传者：管理员

摘要：目的总结肝豆状核变性(WD)儿童临床表型特征及其ATP7B基因突变谱变化。方法 2020年1月～2023年1月我院收治的WD患儿62例，其中肝病组41例(临床型11例和亚临床型30例)和神经病组21例(临床型6例和亚临床型15例),采用直接测序法检测外周静脉血ATP7B基因突变谱，登录ATP7B突变数据库，比对突变结果。采用火焰原子吸收光谱法检测24 h尿铜和血清铜蓝蛋白。结果肝病组起病年龄、角膜K-F环发生率、血清谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为(6.1±2.5)岁、17.0%、(149.6±51.3)U/L和(157.0±25.7)μg,与神经病组【分别为(9.6±2.9)岁、76.1%、(67.1±11.0)U/L和(272.2±30.8)μg】比，差异均具有统计学意义(P<0.05);临床型肝病组起病年龄、角膜K-F环、血清胆汁酸、谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为(6.8±1.9)岁、54.5%、(158.5±23.6)μmol/L、(279.6±17.5)U/L和(196.6±62.8)μg,与亚临床型肝病组【分别为(5.1±2.3)岁、3.3%、(16.1±4.1)μmol/L、(90.5±12.1)U/L和(118.1±41.0)μg】比，差异均具有统计学意义(P<0.05),临床型神经病组角膜K-F环、血清胆汁酸、谷丙转氨酶和24 h尿铜水平分别为100.0%、(26.8±5.8)μmol/L、(96.7±10.1)U/L和(376.5±48.9)μg,与亚临床型神经病组【分别为66.7%、(14.4±3.2)μmol/L、(48.5±5.2)U/L和(214.7±55.4)μg】比，差异均具有统计学意义(P<0.05);在ATP7B基因突变谱中，c.2333G>T(Arg778Leu)见于41个等位基因，等位频率占比为33.1%,其次为c.2975G>T(Pro992Leu),见于10个等位基因，等位频率占比为8.1%,再次为c.2621C>T(Ala874Val)、c.1708-5t>g(Ala874Val)和c.994G>T(Glu332stop),等位频率占比分别为4.8%、3.2%和3.2%;检测到错义突变34种，插入突变15种，剪切突变8种，无义突变5种；复合杂合突变45例，杂合突变7例，纯合突变10例；肝病组与神经病组前5致病变异基因(p.Arg778Le、p.Pro992Leu、p.Ala874Val、IVS4-5:t>g和p.Glu332stop)突变频率比较无统计学差异(P>0.05)。结论 WD儿童以肝脏受累多见，排名前5位的致病变异有Arg778Leu、Pro992Leu、Ala874Val、Ala874Val和Glu332stop,因此为诊断可以优先选择检测这些热点基因，但基因检测可能无法预测临床表型。

关键词：
ATP7B
临床表型
儿童
基因突变谱
肝豆状核变性
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儿童肝豆状核变性(Wilson's disease, WD)是一类常染色体隐性遗传疾病，主要因为机体铜代谢障碍，使铜沉积于肝和脑等重要脏器，导致相应的功能损害[1,2]。ATP7B是WD的致病基因，其突变后将会引起肝硬化、帕金森综合征、肾损害和关节病变等[3,4]。WD属罕见的一类可治疗的遗传病，因此尽早诊治该病显得尤为重要。研究表明，WD的临床症状繁多冗杂，且目前的生化检测无法早期发现症状前患者，显著增加了早期确诊的难度[5,6]。由于该病发病率较低，我国对WD的研究仍局限在小样本人群，而国外的好发人群与我国国人存在较大的异质性，主要症状也不尽相同[7,8]。因此，关注我国WD儿童ATP7B基因突变谱变化，可帮助确立基因诊断方法，从而加快临床早期识别和诊治。本文总结了WD儿童ATP7B基因突变谱的变化及其与临床表型的关系，重点分析了热点致病突变基因的种类、位置和突变频率，现报道如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

2020年1月～2023年1月我院收治的WD患儿62例，其中肝病组41例，男22例，女19例，平均年龄为(7.15±2.31)岁；神经病组21例，男14例，女7例，平均年龄为(7.28±2.17)岁。WD分型：①有肝脏受累的表现为肝型，如出现急性或慢性血清转氨酶异常增高等；有神经系统受累的表现为神经型，如出现肌张力异常增高或降低、精神症状等；以其它系统受累的类型统称为其它类型，上述类型的组合为混合型。②无特异临床表现，仅通过辅助检查确诊为肝功能损害者为亚临床型；出现黄疸、肝区痛、步调异常、水肿等临床表现为临床型。其中临床型17例(肝病11例，神经6例),亚临床型45例(肝病30例，神经15例)。本研究经我院医学伦理委员会审核、通过，纳入患儿法定监护人签署知情同意书。

1.2 ATP7B基因突变谱检测

采用直接测序法检测ATP7B基因突变谱。采集外周静脉血3 ml, 取血细胞，使用DNA提取试剂盒(美国TEXAS BIO GENE公司)抽提DNA。取DNA样品，加入蛋白酶K 20μL,充分混匀后56℃水浴10 min。加入无水乙醇200μL,12000 r/m离心2 min, 弃上清液。使用GET3XG基因扩增仪(柏恒科技有限公司)进行PCR扩增外显子，测定ATP7B基因全部外显子和旁侧区，并筛查启动子和5’-UTR区突变。根据不同引物，给予相应的退火温度，而后使用1.5%TAE琼脂糖凝胶(康为世纪有限公司)电泳，取纯化产物2μL和单向引物2μL进行测序反应，而后96℃ 变性10 s, 60℃ 退火5 s, 每循环4 min, 共25个循环。将测序产物纯化并应用Chromas软件得到测序图。将扩增后的产物送上海生工公司测序，将结果序列与NG_008806.1标准序列相比较，进行正反向双序验证，获得序列变化结果。登录ATP7B突变数据库，比对突变结果，确认结果中的变化是否为致病性突变。

1.3 指标检测

采用火焰原子吸收光谱法检测24 h尿铜和血清铜蓝蛋白；使用瑞士Roche公司生产的Cobas ISE600型全自动生化分析仪检测血生化指标。

1.4 统计学方法

应用SPSS 26.0软件进行统计学分析，应用Shapiro-Wilk进行正态性检验，对符合正态分布的计量资料以表示，采用t检验；计数资料以%表示，采用x2检验或Fisher确切概率计算。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肝病与神经病患儿有关指标比较

神经病患儿起病年龄、角膜K-F环和24 h尿铜水平显著大于或高于肝病组，而血清谷丙转氨酶水平显著低于肝病组(P<0.05,表1)。

2.2 临床型组与亚临床型组有关指标比较

临床型组有关指标异常程度显著大于亚临床型组(P<0.05,表2)。

2.3 本组患病儿童ATP7B基因突变谱情况

在ATP7B基因突变谱中，c.2333G>T(Arg778Leu )见于41个等位基因，等位频率占比最高(33.1%);排名第二的为c.2975G>T(Pro992Leu),见于10个等位基因，等位频率占比为8.1%;再次为c.2621C>T(Ala874Val)、c.1708-5t>g(Ala874Val)和c.994G >T(Glu332stop),等位频率占比分别为4.8%、3.2%和3.2%(表3)。检测到错义突变34种，插入突变15种，剪切突变8种，无义突变5种(资料未列出);复合杂合45例，杂合突变7例，纯合突变10例。

表1 两组有关指标

表2 临床型组与亚临床型组有关指标

表3 本组患病儿童ATP7B基因突变谱(前五位致病突变)

2.4 肝病与神经病患者热点突变检出率比较

两组前5位致病变异基因突变检出率比较无统计学差异(P>0.05,表4)。

表4 不同临床型患者热点突变检出率(%)比较

3、讨论

WD是一种可治疗的遗传性疾病，基因突变与该病的发生发展存在密切的关系。若尽早发现该病，提前治疗，多数情况下预后良好。WD临床表现复杂多样，人群基因异质性较大，实验室铜代谢检测的灵敏度和特异度较低，因为筛查技术的限制使得临床诊治的难度加大。

研究表明，患病年龄较小的患者以肝脏受累为主，青少年或成年起病则以神经系统表现为主[9,10]。本组肝病占比为66.1%,推测可能与纳入人群均为低龄患儿有关。因此，临床上对于低龄儿童发生原因不明的肝损害应警惕WD的发生。本研究分析了我国WD患儿5个热点突变基因，针对以上热点突变基因进行检测，可提高检测诊断的灵敏度。结合高频突变热点建立特异性的PCR检测方法，对症前WD患者检出率明显提高，遗传分析的准确率也显著提高[11,12]。p.Arg778Leu参与铜转运的生理学过程。本研究发现p.Arg778Leu是最高发突变基因。p.Arg778Leu突变患者血清铜蓝蛋白水平较低[13,14]。有学者对我国南方WD患者突变热点基因进行总结后发现，p.Arg778Leu是最常见的突变，与本研究结果一致[15,16]。p.Pro992Leu为排名第二位的突变基因，其突变多见于黄种人，但也有学者认为，I1148T才为占比第二位的突变基因[17,18]。p.Ala874Val是第三位的突变基因。有研究指出，韩国p.Ala874Val占比为第二位[19]。本文分析WD患者ATP7B基因突变谱变化，试图寻找不同临床表型所对应的基因突变谱的变化，但并未发现肝病与神经病组存在显著性差异。有研究检测江苏地区WD人群基因后发现，各临床表型均存在Arg778Leu突变[20]。WD临床表现复杂不一且起病隐匿，本组75.5%(45/62)患者为亚临床型。亚临床型患者无特异性临床表现。有研究指出，多基因突变患者血清谷丙转氨酶水平显著大于单一基因突变者，因此将基因谱单一位点的变化选为研究目标，可能很难发现其与临床表型的关系。本文重点关注了概率较大的前5位热点突变基因，而罕见基因的变化也需要加强研究。关于基因型与临床表型的关系研究还需要进一步明确。

综上所述，WD患儿多出现肝脏病变，Arg778Leu、Pro992Leu、Ala874Val、Ala874Val和Glu332stop是致病性的热点突变基因。WD患儿临床表型与ATP7B热点突变基因的关系还需要深入研究。

参考文献:

[6]纪雷,张莹,孔丽,等.83例肝豆状核变性患者的临床特征分析.临床肝胆病杂志,2022,38(8):1843-1846.

[7]胡亚欣,程卓,丛硕,等.肝豆状核变性家系全基因组分析1例报告.临床肝胆病杂志,2022,38(7):1616-1619.

[12]张天鹤,毛志芹.儿童肝豆状核变性的临床特点及基因分析(附70例报告).中国实用儿科杂志,2022,37(2):135-139.

基金资助:浙江省嘉兴市科技计划项目(编号:2021AD30089);

文章来源:严盼盼,黄晓霞,祝峰等.肝豆状核变性儿童临床表型与ATP7B基因突变谱变化研究[J].实用肝脏病杂志,2024,27(02):218-221.