地中海贫血（简称地贫）是全球最常见的单基因隐性遗传疾病之一，发生的分子机制复杂，突变类型多种多样。当前，主流的地贫基因检测技术是跨越断裂点聚合酶链反应（Gap-PCR）及聚合酶链反应结合反向斑点膜杂交技术（简称PCR-RDB），可以诊断约95%-98%的地贫基因型[1]，另有2%-5%的罕见或未知突变地贫基因型需要使用其他检测技术进行诊断。花都区位于广州北部地区，属于地贫高发区，以往本团队对花都区育龄人群进行过常见地贫基因型的相关报道[2]，目前该地区罕见地贫基因型的分布却未见报道，虽然罕见地贫在人群中的携带比例不高，但在地贫高发的地区，由于人口基数大，当罕见地贫基因携带者与常规α-地贫或β-地贫基因携带者婚配时，可有25%的概率诞下中重型地贫患儿，所以，罕见地贫基因型的分布同样应该引起足够的重视。近年来，随着分子检测技术的快速发展和外来人口的不断加入，越来越多的罕见地贫基因型被检出，使得本地人群地贫基因型变得更加复杂多样，这就给本地区地贫防控工作带来了很大的挑战。本研究将对近年来花都地区育龄人群的常见和罕见基因型分布和构成进行回顾性分析，阐明当前人群携带的常见和罕见地贫基因型图谱，以建立和完善该地区的地贫基因型数据库，为该地区现阶段地贫精准防控措施的实施提供科学依据。

一、资料与方法

研究对象

2016年1月至2022年10月花都地区参加地贫基因检测血液学筛查的育龄受检者（包括地贫疑似患者和免费地贫筛查夫妇）共计60 622例，其中36 412例为血液学初筛阳性或疑似地贫者需要进行地贫基因检测，年龄18-55岁。纳入标准：经过基因检测为携带常见和罕见α-和β-地贫基因型者；排除标准：缺铁性贫血、其他类型的血红蛋白病。本研究已获得受检者本人或监护人知情同意，经过广州市花都区妇幼保健院伦理委员会批准。

仪器与试剂

DNA提取试剂、PCR扩增试剂和αβ-地贫基因检测试剂盒（潮州凯普生物化学有限公司），HFsafe-900TE生物安全柜（上海力申），Sysmex XN-1000全自动血液分析仪（日本Sysmex公司），Capillary2全自动毛细管电泳仪（法国Sebia公司），TC-XP-E扩增仪（杭州博日公司），ABI 3500 DNA测序仪（美国ABI公司），HB-2012A医用核酸分子快速杂交仪（广东潮州凯普公司）及DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

血液学参数

无菌采集受检者外周血2 ml，采用乙二胺四乙酸二钾充分抗凝，采用Sysmex XN-1000全自动血液分析仪测定平均红细胞体积（MCV）（参考范围：82.0-100.0 fl）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）（参考范围：27-34 pg）、血红蛋白（Hb）（参考范围：男120-180 g/L，女110-170 g/L），使用Capillary2全自动毛细管电泳仪检测受检者血红蛋白A(Hb A）值（参考范围：94.5%-97.5%）、血红蛋白A2(Hb A2）值（参考范围：2.5%-3.5%）、血红蛋白F(Hb F）（参考范围：0-2.5%）值及其他异常Hb。根据广东省地贫产前筛查的标准：MCV<82 fl和（或）MCH<27pg且Hb A2>3.5%或者Hb A2<2.5%者，或存在血红蛋白F(Hb F)>2.5%者或有Hb H、Hb CS条带者、或存在异常Hb为初筛阳性，分别进行α-和β-地贫基因检测。

常见地贫基因型检测

严格按照核酸提取操作流程提取外周血样本中的DNA，采用Gap-PCR+导流杂交技术检测中国南方3种常见的α-地贫基因缺失型：--SEA、-α3.7、-α4.2,3种α-地贫基因点突变：αCSα、αQSα、αWSα,17种常见β-地贫基因点突变：IVS-II-654(C-T）、-29(A-G）、CD71-72(+A）、-30(T→C)-32(C→A）、CD14-15(+G）、CD17(A-T）、βE(G-A）、-28(A-G）、CD43(G-T）、CD27-28(+C）、CD41-42(-TCCT）、IVS-I-5(G-C）、CAP(A-C或-AAAC）、IVS-I-1(G-T,G-A）、Int(T-G）、CD31(-C）。

罕见地贫基因型检测

对于常规地贫基因型与血液学表型不符或者怀疑为罕见地贫的样本，送凯普公司进行罕见地贫基因型检测：采用Gap-PCR和琼脂糖凝胶电泳方法进行缺失型α-和β-地贫基因型检测；采用一代测序进行α-和β-地贫基因点突变检测；当检测膜条显示4.2浅点时，需要进行α-地贫融合基因（Fusion gene）检测；当正常对照点、SEA、3.7或4.2三点同时出现时则进行罕见香港型检测。

统计学分析

使用Microsoft Excel 2007对数据进行录入、整理，用描述性方法进行α和β-地贫基因型统计分析。

二、结果

广州市花都地区人群地贫基因阳性率

在36 412例全血样本中，男性17 660例，女性18 752例，共检出16 171例地贫基因阳性（44.41%），常见地贫基因型16 057例（44.10%），男性7 903例（49.22%），女性8 154例（50.78%），男性检出率为44.75%，女性检出率为43.48%。常见α-地贫基因突变10 845例（29.78%），常见β-地贫基因突变4 531例（12.44%),αβ复合型地贫基因突变681例（1.87%）。罕见地贫基因型114例（0.31%），男性55例（48.25%），女性59例（51.75%），男女性检出率均为0.31%。其中罕见α-地贫基因突变48例，占罕见地贫基因型42.1%，罕见β-地贫基因突变52例（45.6%），罕见αβ复合型地贫基因突变14例（12.3%）。男性与女性地贫基因检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

常见α-地贫基因型检测结果

共检出27种常见α-地贫基因突变类型，前三位分别为--SEA/αα占63.17%,-α3.7/αα占18.69%,-α4.2/αα占7.02%，点突变依次为αWSα/αα占2.89%,αCSα/αα占2.40%,αQSα/αα占1.84%（表1）。

常见β-地贫基因型检测结果

共检出18种常见β-地贫基因型，以β41-42/βN最多，构成比为38.87%，其次为β654/βN，构成比为27.72%,β-28/βN占13.42%（表2）。

常见αβ-地贫基因型检测结果

αβ复合地贫基因突变类型以--SEA/αα,β41-42/βN最多见，占15.86%，其次是--SEA/αα,β654/βN，第三位是-α3.7/αα,β41-42/βN，基因突变类型丰富多样（表3）。

罕见地贫基因型检测结果

共检出罕见地贫基因型114例，罕见α-地贫检出率为0.13%(48/36 412），罕见β-地贫检出率为0.14%(52/36 412）。罕见α-地贫共检出14种类型，以Fusion gene/αα最多，其次为--SEA/HKαα；检出罕见α点突变αIVS II-55α/αα、αCD40α/αα、αIVS II-119α/αα、αCD 124α/αα等基因型；检出罕见β-地贫共52例，检出11种类型，以βSEA-HPFH/βN最多、βGγ(Aγδβ)0/βN次之；检出罕见β点突变β-90/βN、βCD37/βN、β-88/βN、βIVS II-667/βN等基因型；检出罕见型αβ复合地贫14例，10种类型，以--SEA/αα,βGγ(Aγδβ)0/βN、--SEA/αα,βSEA-HPFH/βN多见，具体基因型见表4，罕见αIVS II-55α/αα和βCD37/βN基因型测序结果见图1-2。

三、讨论

地贫是一组严重威胁人类健康的致死、致残的慢性溶血性常染色体隐性遗传病，在全球广泛分布，主要流行于地中海沿海地区，我国主要分布在南方地区，轻者无临床表现，重者可致残、致死，目前无根治方法，唯一经济有效的方法是开展地贫筛查和基因检测。目前，地贫筛查的模式是采用血常规联合血红蛋白电泳分析进行初筛，对初筛阳性的样本进行地贫基因检测。

本研究对36 412例地贫样本进行检测，常见和罕见地贫基因在男性和女性中的检出率均无统计学差异。常见地贫基因型检出16 057例（44.10%），常见α-地贫缺失型基因型顺位分别为以--SEA/αα缺失型为最多，其次为-α3.7/αα和-α4.2/αα，这与海南省以-α3.7/αα最多、-α4.2/αα次之、--SEA/αα第三位的α基因型分布有差异[3]，而与我国南方如广东、广西、四川、湖南等地报道结果一致[4-7]。3种α突变型（αCSα、αQSα、αWSα）共774例（2.13%），以αWSα最多，αCSα次之；检出Hb H病318例（0.87%），以--SEA/-α3.7最多，--SEA/αWSα表型仅有轻度贫血，而--SEA/-α3.7、--SEA/αCSα则表现为中重度贫血，由于中间型地贫分子机制复杂，使得其表型差异较大，轻者只有轻度表型，没有明显的临床症状，重者则需要定期输血治疗，出现肝脾肿大等明显的地贫特征[1]，所以对Hb H病的患者应该根据具体的基因型提供相应的临床遗传咨询和产前诊断。本研究共检出常见β-地贫基因型4 531例（12.44%），占前3位是β41-42/βN、β654/βN、β-28/βN，与之前本团队报道的育龄人群基因型分布一致[8]，而与海南报道以β41-42/βN最多、β-28/βN次之却不相同[9]，与广西β41-42/βN最多、β17/βN次之也不同[5]，表明不同省份的人群β-地贫基因型分布存在差异性。常见α复合β地贫基因以--SEA/αα,β41-42/βN最常见，与本团队之前报道的育龄人群αβ-地贫基因型一致[10]，与广东省其他地区报道也相同[11]，与海南地区以-α3.7/αα,β654/βN最多见不一致[3]，与湖南地区以--SEA/αα,β654/βN是最常见的基因型也不相同[7]，说明α和β-地贫均具有明显的地域和人群差异性。

本研究检测出罕见地贫基因型114例，检出率为0.31%，表明广州花都地区存在相当比例的罕见地贫基因型，该地区应该重视罕见地贫基因型的检测。罕见地贫基因型主要以杂合子为主，其中α基因变异占48.94%,α点突变可发生于α1、α2基因上，但多数发生在功能较强的α2基因上；β基因变异占51.06%，罕见突变在基因外显子、内含子区域，编码区和非编码区均可发生，部分点突变可引起相应的血液学表型变化。检出罕见α-地贫48例，14种类型，其中包括缺失、融合、点突变，以Fusion gene/αα 19例最多，其次为--SEA/HKαα;Fusion gene/αα最先是在2013年1例家系分析中被检出，证实是α2和Ψα1基因相互融合所形成，符合常染色体隐性遗传，属于α+-地贫，在合并--SEA时可以出现中重度贫血[12]。2019年报道1例海南黎族家系分析，在合并其他类型地贫时致病效果与中间型地贫相似[13]；本团队以往已有Fusion gene的相关报道[14-15]。花都地区Fusion gene/αα携带者均无临床表型，MCV、MCH和HBA2在临界范围，这与以往的报道不一致[12-13]，是人群特征还是分子机制的原因还有待进一步研究。检出1例Fusion gene/αCD30α，其血液学参数分别为Hb 126 g/L,MCV78.7 fl、MCH 25.5 pg,Hb A21.6%，有异常血红蛋白条带Hb6 zone 32.20%,Hb1 zone 0.80%。另外1例Fusion gene/αα复合β654/βN血液学参数分别为Hb137 g/L,MCV 67.8 fl、MCH 21.1 pg,HbA25%，可见Fusion gene/αα血液学表型会在合并其他类型的基因型时会有所改变。本研究检出香港型类型有HKαα/αα、--SEA/HKαα、-α4.2/HKαα,HKαα/αα基因型由于不存在基因量的减少，所以其血液学表型与正常人无差异，属于静止型地贫，当HKαα/αα被误诊为-α3.7/αα、配偶为--SEA/αα时，则会引起不必要的产前诊断，而当HKαα/αα合并β-地贫时，α和β不平衡增加，从而使个体表现出中重型地贫表型。--SEA/HKαα由于含有功能性的α基因，其血液学表型变化与--SEA/αα相似，而无Hb H病的临床表现，临床属于轻型地贫，所以当配偶一方为--SEA/αα而另一方为HKαα/αα时则不需要进行产前诊断[16]，以免引起不必要的医疗资源浪费和孕妇的恐慌焦虑。IVS II-55是内含子区发生突变，李育敏等[17]报道杂合子血液学表型正常，但是本研究病例表现为MCV、MCH降低，与其报道不一致，可能与地域及人群种族相关，有待大样本的收集研究。

本研究检出罕见β-地贫共52例，11种类型，大片段缺失型以βSEA-HPFH/βN、βGγ(Aγδβ)0/βN为主，两者均以Hb F升高为特征，但两者的发病机制不同，在合并其他类型基因型时血液学表型有所差异，本团队已有相关报道[18]。检出HBB:c.113G>A(CD37 TGG>TAG）位点杂合突变的β-地贫1例，HBB:c.113G>A该突变为β-基因编码区序列的113号碱基G突变为A，对应的编码氨基酸由色氨酸改变为终止密码子，为致病性突变，临床表型为β0，有轻度贫血，但广西有1例CD37杂合子报道有中度贫血[19]，也有报道称此突变合并-α3.7/αα和--SEA/αα后表型与单纯CD37杂合子类似[20-21]，提示合并α-地贫后对该突变杂合子病例的临床症状并无影响，是携带基因型差异还是人群种族差异还需更多样本进行研究和验证。

本研究结果显示，花都地区的常见和罕见地贫基因型复杂多样，应该特别重视罕见地贫基因型的检测，实验室人员在临床工作中一定要坚持基因型和血液学表型相一致的原则。对于该地区出现的相对高频的特有的罕见地贫基因型，如Fusion gene/αα、--SEA/HKαα、SEA-HPFH、Gγ(Aγδβ)0、-88、-90等，从遗传咨询和地贫防控角度考虑应当纳入花都地区免费地贫筛查范围。本研究结果有助于建立花都地区常见和罕见地贫基因库，更精准地开展产前遗传咨询和地贫防控工作，对提高该地区的人口质量具有重要意义，为完善该地区地贫防控措施提供了科学依据。

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基金资助:广东省医学科研基金立项项目(B2022066); 广州市花都区基础与应用基础研究区院联合资助项目立项(23HDQYLH27);

文章来源:鞠爱萍,付晓彤,林铿,等.广州市花都地区育龄人群常见和罕见地中海贫血基因型分析[J].中国实验血液学杂志,2024,32(05):1496-1502.