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药品微生物计数用培养基保存期限探讨

2024-07-12 22 上传者：管理员

摘要：对药品微生物计数用自制培养基的保存期限进行研究，确定保存条件及期限。以现配培养基为对照，比较常温避光和2～8℃避光两个条件下不同保存期内的培养基对微生物的促生长能力。结果表明，在180 d的保存期内，培养基适应性检查结果在0.64～1.85之间。药品微生物计数用培养基经配置灭菌后常温避光保存，在180 d的保存期内可符合使用要求。

关键词：
优质培养基
保存期
培养基
培养细菌
微生物繁殖
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培养基是指用于培养细菌、细胞、组织或生物体的固态或液态混合物，用于保证微生物繁殖、鉴定或保持其活力的物质[1]。微生物的生长繁殖会受到营养、pH值、温度及气体等因素的影响，因此，培养微生物需要给微生物提供相应的适宜条件。培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。规范的配制过程、适宜的储存条件和科学的质量验收试验是提供优质培养基的重要保证[2]。微生物实验室使用的培养基，分为商品化的预制培养基和脱水培养基。对于预制培养基，生产培养基的厂家都会给出明确的贮藏条件和使用期限，实验室只要严格按照标示的贮藏条件进行保存，在标识期限内使用，培养基的质量即可得到保证。对于脱水培养基，在使用之前有一个配制过程，配制后一般需经灭菌处理后方可使用。灭菌后的这些培养基，在实验室的贮存条件和使用期限，培养基生产厂家不会做规定，也不提供相关实验数据。实验室在使用这类培养基的过程中，应该如何保存，保存期限可以多长，才能保证其质量性能，是实验室需要充分考虑的重要因素[3,4]。本论文拟参照《中国药典》及GB4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》对培养基质量要求的规定[5,6,7,8]，结合培养基成分分析，对《中国药典》中微生物计数法使用的脱水培养基其配制后的保存条件和保存时限进行研究，以提供数据依据及建议。

1、设备材料

1.1 仪器设备

高压灭菌锅（致微）、恒温干燥箱（博讯）、2级生物安全柜（苏净）、生化培养箱（博讯）、霉菌培养箱（博讯）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌[CMCC(F) 98001]、黑曲霉[CMCC(F) 98003]，以上均由北京陆桥技术有限公司购得的定量工作菌株，菌株代数均为第4代，规格102～103CFU/支。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂（环凯、陆桥、BD）、沙氏葡萄糖琼脂（环凯），均为脱水培养基。

2、方法与结果

2.1 实验环境

菌悬液制备、接种，倾注培养基等实验操作均在2级生物安全柜中开展。

2.2 菌悬液制备

取定量工作菌株，用无菌的0.9%氯化钠生理盐水稀释成浓度不超100 CFU/mL的菌悬液。

2.3 培养基配制

取脱水培养基，按照使用说明配制，分装于500mL三角瓶，每瓶400mL，塞硅胶塞，牛皮纸捆绑包裹瓶口后湿热灭菌，灭菌温度：121℃，灭菌时间：15min。灭菌后培养基进行分组，一组常温避光保存，一组2～8℃冷藏避光保存。保存期为7d、15d、30d、60d、90d、180d。临使用前复熔，水浴45℃保温。

2.4 试验方法

以临用前现配的培养基作为对照，分别与不同保存期的上述两组培养基进行促生长能力检查结果比对。胰酪大豆胨琼脂的指示菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉[5]。取各菌悬液1mL分别注入平皿中，平行制备2个平皿，立即倾注15mL～20mL45℃保温的培养基，混匀，同时做空白对照，置32.5℃培养48h后点计培养基上生长的菌落数，计算被检查培养基与对照培养基上菌落数的比值。沙氏葡萄糖琼脂的指示菌为白色念珠菌、黑曲霉[5]。试验方法同胰酪大豆胨琼脂，培养温度22.5℃，培养时间72h。

2.5 试验结果

被检查培养基与对照培养基上的菌落形态大小应一致，且菌落数的比值在《中国药典》对培养基适用性检查规定的0.5～2.0范围内，可认为培养基满足实验需求。

2.5.1 不同保存期的胰酪大豆胨琼脂培养基促生长能力检查

对7d～180d保存期的胰酪大豆胨琼脂培养基促生长能力进行检查，结果详见表1。空白对照平皿均无菌落生长，表明培养基未受微生物污染。各指示菌在两组培养基上生长良好，形态、颜色及大小均与在对照培养基上一致，菌落数的比值在0.64～1.71之间。表明，配制好的胰酪大豆胨琼脂培养基，在本试验的保存条件及期限内，质量稳定，符合要求。表1 不同保存期内的胰酪大豆胨琼脂培养基促生长能力检查

2.5.2 不同保存期的沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力检查

对7d～180d保存期内的沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力进行检查，结果详见表2。空白对照平皿均无菌落生长，表明培养基未受微生物污染。各指示菌在两组培养基上生长良好，形态、颜色及大小均与在对照培养基上一致，菌落数的比值在0.78～1.85之间。表明，配制好的沙氏葡萄糖琼脂培养基，在本试验的保存条件及期限内，质量稳定，符合要求。

2.5.3 不同厂家不同保存期自制培养基促生长能力检查

以胰酪大豆胨琼脂培养基为例，对3个不同厂家7d～180d保存期内自制培养基的适用性进行了探讨，试图从保存期角度来评估不同厂家培养基的质量情况，结果详见表3。结果表明，市售3个主流厂家的胰酪大豆胨琼脂，在180d保存期内，菌落数的比值在0.64～1.71之间，符合培养基适用性检查要求，说明不同品牌间180d保存期内培养基质量稳定，满足实验需求。

3、讨论

脱水培养基未加水配制之前的保存要求避免阳光直射，在本实验中，配制好的脱水培养基参照配制前的保存条件，避光保存。实验表明：在常温和2-8℃两个条件下，相对现配的培养基，试验的培养基在180 d的保存期内，指示菌与对照培养基菌落数比值均在0.5～2.0范围内，对指示菌的促生长能力良好。试验用的两种培养基均是非选择性培养基，没有对微生物生长的抑制剂，也没有对热不稳定的成分，胰酪大豆胨琼脂的配方组分包含有大豆水解物、胰酪胨、氯化钠、琼脂等成分，沙氏葡萄糖琼脂的配方组分包含有动物组织水解物、胰酪胨，以及葡萄糖和琼脂等成分。其中，胰酪胨、大豆水解物、动物组织水解物提供氮源、维生素和生长因子，其成分多为小片段肽和各种氨基酸，通常在室温下具有良好的稳定性；氯化钠维持均衡的渗透压；葡萄糖提供碳源；琼脂是培养基的凝固剂[9,10]。因此以培养基的促生长能力来作为保存期的评判条件，并将常温保存作为保存条件之一进行考察。通过本实验，结合实验室的质量保证及实验室能耗的绿色低碳，可将常温避光保存，保存期不超过180d作为该两种培养基经配制及灭菌后保存条件及期限。

表2 不同保存期内的沙氏葡萄糖琼脂培养基促生长能力检查

表3 不同厂家胰酪大豆胨琼脂促生长能力检查

对于选择性培养基、鉴定培养基，其配方组分中，除了促生长因子这些营养成分之外，还会添加一些微生物生长抑制剂、生物指示剂，这些成分有相当一部分是对热不稳定。这类培养基可按照本实验的思路，在验证促生长能力的基础上，进行对目标微生物抑制能力的验证、微生物生化鉴定的检查，以确定其保存条件及期限。

参考文献:

[1]郭洁琼.食品微生物检验中培养基的质控对策研究[J].食品安全导刊,2023(16):32-34.

[2]王雪吟,李建丽.论食品微生物检验中培养基的质量控制[J].食品安全导刊,2023(16):45-47.

[3]高嘉明,蔡双福,刘绍芳,等.平板计数琼脂贮存条件的研究[J].现代食品,2020(15):152-153.

[4]戴宇婷,赵晓星,张金玺.药品检验用计数培养基配制､灭菌及贮藏研究[J].中国卫生标准管理,2020,11(1):94-97.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典四部[M].北京:中国医药科技出版社,2020.

[6]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京:中国医药科技出版社,2017.

[7]中国食品药品检定研究院.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2019.

[8]GB4789.26-2013食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求[S].2013.