原发性支气管肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌是最常见的类型。肿瘤细胞离开原发病灶向远处转移是恶性肿瘤的发展的重要表现。目前，肺腺癌药物治疗方式包括化疗、靶向药物、免疫治疗药物、抗血管生成药物及双特异性抗体药物等。但经过综合治疗后，仍然会出现耐药及复发转移，致使患者预后较差，因此仍然需要探索和寻找新的治疗药物或增敏策略。抗肿瘤新药的开发需要大量研发成本和时间，而由于寄生虫病和癌症之间的相似性以及多年来抗寄生虫药物的成功临床管理，有望从现有抗寄生虫药物中寻找和开发潜在的新抗肿瘤药物[1]。自噬是一种保守的分解和代谢的过程，可以将功能失调或受损的蛋白质和细胞器等代谢降解以维持生物大分子的合成[2]。自噬与癌症有着密切关系，近年来有研究表明，自噬在肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移中具有重要的调节作用，进而影响药物治疗效果，激活自噬可以通过多种信号途径，如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）信号途径等抑制一些癌细胞增殖、上皮–间充质转化（EMT）过程及癌症的转移，提示靶向调控自噬具有抑制肺癌发生发展的重要作用。

苯并咪唑类驱虫药，如甲苯咪唑、阿苯达唑和氟苯达唑是治疗广谱寄生虫蠕虫的长期药物，它可以干扰微管的形成、葡萄糖摄取和ATP的形成，从而抑制寄生虫存活和繁殖[3]。芬苯达唑是一类苯丙咪唑类的药物，已广泛用于人和动物中抗肠道寄生虫，其作用机理有2种理论，一种认为药物通过抑制线虫的延胡索酸还原酶而发挥驱虫作用，另一种理论认为抑制蠕虫线粒体的电子传递体系和电子传递体偶联的磷酸化反应，抑制与微管形成有关的葡萄糖转运系统，进而使ATP的合成受阻[4]。研究报道，芬苯达唑是一种微管靶向剂，在体外实验中可以干扰癌细胞有丝分裂微管形成，抑制癌细胞增殖。此外，其还干扰癌细胞葡萄糖摄取和代谢、破坏癌细胞线粒体及p53的稳定，促进癌细胞凋亡[5-7]。

本研究旨在探讨芬苯达唑对肺腺癌的自噬及增殖、侵袭和迁移能力的影响，为抗寄生虫药物老药新用治疗肿瘤提供新的理论依据和见解。

1、材料与方法

1.1 试剂及抗体

芬苯达唑（质量分数99.84%，批号29107）、氯喹（质量分数99.89%，批号159402）、二甲基亚砜（批号344768）均购于美国Med Chem Express公司。将芬苯达唑溶解在DMSO中至浓度为100 mmol/L，储存在-80℃，并在实验前用培养基稀释至操作浓度。CCK-8试剂盒购买于上海碧云天生物技术股份有限公司。N-钙黏蛋白抗体（N-cadherin，批号4）、细胞角蛋白抗体（Cytokeratin，批号1）、波形蛋白抗体（Vimentin，批号2）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3抗体（LC3A/B，批号5）、鳌合体1抗体（SQSTM1/P62，批号4）、Beclin-1抗体（批号6）、β-actin抗体（批号5）均购于美国Cell Signaling Technology。纤维连接蛋白抗体（FN1，批号QC49725-42173）、紧密连接蛋白抗体（Occludin，批号098M4799V）购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 细胞及培养

人肺腺癌细胞系（A549、H358）购自中国科学院细胞库。2株细胞均在含有10%胎牛血清、青霉素–链霉素–谷氨酰胺的培养基中培养，并置于37℃、5%CO2的培养箱中。

1.3 CCK-8实验

将A549和H358细胞用胰蛋白酶消化，以每孔100μL、4 000个细胞接种于96孔板，每组设置3个复孔。在细胞培养箱孵育24 h，分为对照组（不加药）和芬苯达唑组（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）。药物处理24 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续孵育2 h后，使用Spectramax I3酶标仪测量450nm处的吸光度（A）。通过A值计算细胞活力并绘制曲线。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，24 h后按上述方式进行检测。

1.4 细胞计数实验

将A549和H358细胞以1×106个细胞、2 m L接种在6孔板中，细胞培养箱孵育24 h后加入不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）的芬苯达唑，续孵育24 h后，胰蛋白酶消化后离心，PBS重悬后用血细胞计数器手动计数。

1.5 划痕实验

A549和H358细胞在6孔板（1×106）上铺板，当细胞贴壁后，通过用一次性1 m L枪头做水平划痕以获得无细胞的空间，PBS洗去脱落细胞并吸尽，加入含有不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）芬苯达唑的无血清培养基。0时刻组在划痕完成后立即在显微镜下拍摄划痕区域，24、48 h组在划痕完成分别在24、48 h时在显微镜下拍摄划痕区域，用Image J软件进行处理分析。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑5μmol/L同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，并单独设置氯喹10μmol/L组，0、24、48 h后按上述方式进行检测。

1.6 Transwell侵袭实验

在24孔板中加入500μL含不同浓度（0、1、2.5、5、10、20μmol/L）的芬苯达唑及10%胎牛血清的培养基，将基质胶与无血清培养基以1∶8的比例稀释后（60μL）加入Transwell小室中，后将Transwell小室至于24孔板中，取1×105、200μL的A549和H358细胞悬液加入上室，置于细胞孵箱中培养24 h。取出小室后，24孔板弃培养基，加入4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗后加入结晶紫染色液染色30 min。最后在显微镜下进行细胞计数。在自噬抑制实验中，与芬苯达唑5μmol/L同时加入5、10μmol/L氯喹进行共处理，并单独设置氯喹10μmol/L组，24 h后按上述方式进行检测。

1.7 RT-q PCR实验

使用Trizol试剂对A549细胞进行裂解及提取总RNA。用Prime ScriptTMRT试剂和g DNA Eraser Kit进行逆转录。使用TB Green Premix Ex TaqTM和Bio-Rad CFX96 PCR系统（美国Bio-Rad）和CFX Manager软件（Bio-Rad）检测c DNA样品。引物序列为：N-cadherin上游引物：5’-TCAGGCGTCTGTA GAGGCTT-3’，下游引物：5’-ATGCACATCCTTCG ATAAGACTG-3’;Cytokeratin上游引物：5’-AGAGTGGACCAACTGAAGAGT-3’，下游引物：5’-ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT-3’;Occludin上游引物：5’-ACAAGCGGTTTTATCCAGAGTC-3’，下游引物：5’-GTCATCCACAGGCGAAGTTAAT-3’;Vimentin上游引物：5’-GACGCCATCAACACC GAGTT-3’，下游引物：5’-CTTTGTCGTTGGTTA GCTGGT-3’;FN1上游引物：5’-CGGTGGCTGTC AGTCAAAG-3’，下游引物：5’-AAACCTCGGCTT CCTCCATAA-3’;GAPDH上游引物：5’-GGACCT GACCTGCCGTCTAG-3’，下游引物：5’-CCTGCT TCACCACCTTCTTGA-3’。

1.8 转录组测序及数据分析

将1×106个A549细胞接种在6孔板中并生长过夜后分别用0、5μmol/L芬苯达唑处理细胞24 h，每个浓度各3个复孔。用Trizol试剂进行裂解和总RNA提取。后交由上海生工生物公司进行常规转录组测序。比较0（对照）、5μmol/L芬苯达唑处理后的自噬相关基因的表达。

1.9 蛋白免疫印迹

将1×106个A549细胞接种在6孔板中并生长过夜后分别用0、1、2.5、5μmol/L芬苯达唑处理细胞24 h。重悬于含有蛋白酶抑制剂的100μL裂解缓冲液中，冰上孵育15 min后离心收集上层清液。通过BCA蛋白测定法测量上清液中总蛋白浓度。总蛋白通过10%SDS-PAGE分离、电泳转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用牛血清白蛋白封闭1 h，在4℃下与一抗（N-cadherin、Snail、Keratin 17、Occludin、Vimentin、FN1、LC3、P62、Beclin-1,1∶1 000）孵育过夜。将PVDF膜与二抗（1∶20 000）在室温下孵育2 h。通过ECL试剂盒（碧云天）发光显影蛋白条带，拍照后用Image J软件进行处理和分析。

1.1 0 统计学方法

数据采用表示，采用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析并进行事后检验。

2、结果

2.1 芬苯达唑对肺腺癌细胞增殖的影响

为了研究芬苯达唑在体外抑制人肺腺癌细胞增殖效果，使用CCK8法测定芬苯达唑处理A549和H358细胞24 h后的细胞活力，见图1。随着芬苯达唑浓度的增加，A549和H358细胞的增殖活力逐渐下降（P<0.01、0.001），其中芬苯达唑对A549细胞的增殖活力影响较H358细胞更为显著，且在较低浓度时就能显著抑制A549细胞增殖活性（P<0.001),A549细胞的IC50值1.232μmol/L，见图1A。经芬苯达唑作用后，A549和H358的细胞计数均显著减少（P<0.001），见图1B。结果表明，芬苯达唑在体外以浓度相关性方式有效地抑制了肺腺癌细胞增殖。

图1 细胞增殖活力（A）和细胞计数（B）情况（n=3)

与对照组比较：**P<0.01***P<0.001。

2.2 芬苯达唑对肺腺癌细胞迁移能力的影响

为了评估芬苯达唑对人肺腺癌细胞迁移能力的影响，对A549和H358细胞进行划痕实验，见图2。结果表明，与0 h组相比，在不同浓度芬苯达唑处理24、48 h后能够有效抑制细胞迁移（P<0.05、0.01、0.001），且呈浓度和时间相关性。

图2 在不同浓度下A549和H358细胞迁移情况（n=3)

与0 h组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。

2.3 芬苯达唑抑制人肺腺癌细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，与对照组相比，在芬苯达唑作用24 h后，且随着药物浓度增加，A549和H358细胞穿膜数量显著降低（P<0.001），表明芬苯达唑显著抑制了细胞侵袭，见图3。

图3 在不同浓度芬苯达唑下A549和H358细胞侵袭情况（n=5，×200)

2.4 芬苯达唑对于细胞侵袭迁移相关m RNA和蛋白表达水平的影响

由于A549细胞株对芬苯达唑更为敏感，效果较明显，故后使用A549细胞进行检测上皮–间充质转化相关m RNA及蛋白标志物N-cadherin、Cytokeratin、FN1、Occludin、Vimentin m RNA表达。与对照组相比，随着芬苯达唑药物浓度增加，N-cadherin、Cytokeratin、FN1 m RNA相对表达逐渐下降（P<0.05、0.01、0.001);Occludin、Vimentin m RNA表达水平在低浓度时较高，随着芬苯达唑药物浓度增加Occludin、Vimentin m RNA表达水平降低（P<0.05、0.01、0.001），见图4。

与对照组相比，随着芬苯达唑药物浓度的增加，N-cadherin、Cytokeratin、FN1、Occludin的蛋白相对表达量显著降低，而Vimentin蛋白相对表达水平随药物浓度降低而增高（P<0.05、0.01、0.001），见图5。

2.5 芬苯达唑通过自噬相关途径影响人肺腺癌的侵袭迁移

通过常规转录组测序的结果筛选出自噬相关基因，并使用热图进行结果展示，见图6。结果显示芬苯达唑处理后，A549细胞内自噬相关基因MAP1LC3B(LC3)m RNA水平上调1.42倍（P<0.001),ATG5 m RNA水平上调1.26倍（P=0.025),ULK3 m RNA水平上调1.25倍（P=0.044),ATG16L1m RNA水平上调1.51倍（P=0.003),Bax m RNA水平上调1.26倍（P=0.006），提示芬苯达唑可能激活肺腺癌细胞自噬。

图4 不同浓度下芬苯达唑对A549细胞上皮–间充质转化相关的m RNA相对表达水平的影响

图5 不同浓度的芬苯达唑对上皮–间充质转化相关蛋白表达水平的影响

2.6 芬苯达唑对细胞自噬相关蛋白表达水平的影响

为了验证转录组测序结果以及明确芬苯达唑对细胞自噬的影响，利用Western blotting实验检测了芬苯达唑处理后A549细胞内自噬相关蛋白的变化。结果显示，在芬苯达唑的浓度增加自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II/LC3-I相对蛋白表达量呈升高趋势，SQSTM/P62表达量呈现降低趋势（P<0.05、0.01、0.001），见图7。

2.7 自噬抑制剂对人肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响

使用氯喹处理人肺腺癌细胞阻断自噬后，发现氯喹10μmol/L可以削弱芬苯达唑对A549细胞的增殖抑制作用，呈浓度相关性（P<0.05、0.01、0.001）。而H358细胞仅在高浓度的芬苯达唑中氯喹的逆转作用具有显著性（P<0.05、0.01），见图8。

图6 自噬相关基因表达量热图

Fig.6 Expression level of autophagy-related genes hot map

在划痕和Transwell实验中，24 h时，芬苯达唑10μmol/L+氯喹10μmol/L组A549和H358细胞的相对迁移率显著低于芬苯达唑单独处理组（P<0.01、0.001），表明氯喹可以逆转芬苯达唑引起的A549、H358细胞侵袭和迁移能力降低的作用，见图9、10。

3、讨论

尽管目前已有多种药物用于肺腺癌的临床治疗，然而现有药物在临床应用中会出现响应率低、耐药及复发等问题，使得综合治疗后肺腺癌患者的预后仍然不理想。另一方面，新药的发现与开发面临耗时长、成本高及风险高等困难，因此“老药新用”成为了当前比合成新型药物更快、更经济、低风险策略。

近些年有研究报道，苯并咪唑类药物可能具有抗肿瘤活性[8]。芬苯达唑则是苯并咪唑类化合物中的一种抗肠道寄生虫药物，是一种广谱、高效且低毒性的药物。相对于人或动物细胞而言，芬苯达唑更倾向于干扰寄生虫微管蛋白的稳定性，还参与葡萄糖的摄取与代谢，从而杀死寄生虫，因此被成功应用于治疗寄生虫感染。目前常见的化疗药物如紫杉醇、秋水仙碱等均为微管靶向剂。由此推断，芬苯达唑也可能能够干扰癌细胞微管蛋白稳定性，抑制肿瘤细胞生长，从而具有抗肿瘤的潜力。已有的研究显示，芬苯达唑破坏非小细胞肺癌细胞中微管蛋白网络的稳定性，细胞微管框架扭曲，影响正常细胞周期进行，导致细胞周期停滞于G2/M期[5]。此外，在体外实验中，芬苯达唑也显著抑制了多种癌细胞的增殖、侵袭迁移与集落的形成，诱导癌细胞的凋亡与焦亡等。其引起细胞凋亡的主要通路有抑制癌细胞葡萄糖摄取与代谢[5]；诱导癌细胞中氧化应激导致过量活性氧（ROS）累积[6]；通过激活p38-MAPK通路使得凋亡调节蛋白Caspase-/9和Bax表达显著增加[6]；抑制PI3K/Akt通路、RAF/MEK/ERK通路和STAT1水平[9]；增强p53活性水平及诱导常见p53靶基因的m RNA水平[10]；诱导内质网应激以及线粒体膜去极化、释放细胞色素c激活Caspase-3诱导细胞凋亡[10]。除此之外，芬苯达唑还可通过NF-κB/NLRP3/GSDMD通路促进胶质母细胞瘤U87和U251细胞中NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的表达触发细胞焦亡[8]。本研究也发现，芬苯达唑可以显著抑制肺腺癌细胞增殖且呈浓度相关性，但其中的作用分子机制是否与凋亡或其他细胞死亡方式相关还值得进一步研究探索。

转移复发是肿瘤恶化的重要标志，出现转移复发的患者往往预后较差，而肿瘤细胞发生上皮–间充质转化事在肿瘤转移过程中最重要的第一步，抑制肿瘤细胞这一转变过程能够显著抑制转移发生。上皮–间充质转化是肿瘤细胞活动侵袭性间充质能力的一个过程，包括细胞连接的丢失、细胞骨架的重排以及细胞外基质重塑[11]。EMT涉及不同的信号通路：TGF-β、BMP、RTK、Akt/m TOR信号通路等等，这些途径通过增加间充质细胞标志物的表达，减少上皮细胞标志物表达，最终将上皮细胞的表型转变为间充质干细胞[12]。通过肿瘤细胞经过上皮–间充质转化后，具有免疫逃逸的能力，可以从肿瘤原发部位转移至其他器官组织等。本研究发现，在使用芬苯达唑后，肺腺癌细胞的侵袭迁移能力被显著抑制，且EMT相关的N-cadherin、Cytokeratin、FN1 m RNA相对表达水平及蛋白表达水平随药物浓度增高而降低，说明芬苯达唑具有抑制肺腺癌细胞转移的潜力。有研究发现，除了调控EMT相关分子的表达之外，芬苯达唑还可以通过下调基质金属蛋白酶2/9、β-连环蛋白以及Slug转录因子表达，抑制Hela细胞及胶质母细胞瘤U87和U251细胞的迁移与侵袭[6,8]，这些结果说明芬苯达唑对肿瘤细胞EMT的抑制作用可能会通过多种途经，同时也支持本研究的发现。

图7 不同浓度的芬苯达唑对自噬相关蛋白表达水平的影响

Fig.7 Effect of various concentration of fenbendazole on the expression level of autophagy related proteins

与对照组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。

图8 使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞增殖的影响

与芬苯达唑相同浓度组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001。

自噬是一种高度保守的分解代谢过程，通过将受损的细胞器、病原体和聚集的蛋白转至溶酶体并被溶酶体分解，在维持细胞稳态方面发挥着重要作用[13]，在肿瘤转移中，自噬是一把“双刃剑”，可以抑制或促进癌症的进展，在不同癌症类型、不同阶段以及不同的肿瘤微环境有着不同的作用[14]。在癌细胞转移的早期阶段，自噬可能是通过调节EMT中关键蛋白的不稳定性抑制上皮间充质转化过程抑制癌细胞转移[15-16]。自噬主要受PI3K/Akt/m TOR、Beclin-1、p53和JAK/STAT等信号通路控制[17]。自噬可以通过PI3K/Akt/m TOR、p38 MAPK、Erk1/2和SIRT1介导的信号通路等抑制EMT，在本研究中发现，芬苯达唑通过上调自噬相关基因（如ATG16L1、ATG4A、Bax、BECN1、CCL2、VAMP3等），且通过检测LC3、Beclin-1、P62蛋白表达水平，提示芬苯达唑能够诱导肺腺癌细胞自噬。氯喹是一种自噬体–溶酶体融合抑制剂，在体外和体内严重影响内溶酶体系统和高尔基复合体，通过减少自噬体–溶酶体融合来损害基础自噬通量[18]。目前，还未有研究表明芬苯达唑是通过自噬相关途径抑制癌细胞的增殖及侵袭迁移。本研究发现，芬苯达唑可能激活了自噬上游的信号通路，进而上调的自噬相关基因的转录。而氯喹反向实验说明芬苯达唑这种促进自噬的行为可能会抑制肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。这为芬苯达唑用于肿瘤治疗或辅助现有肿瘤治疗药物提供的理论依据。

图9 使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞迁移的影响

图1 0 使用氯喹与芬苯达唑共作用后对细胞侵袭的影响

参考文献:

[4]王宏磊,刘义明,徐飞,等.芬苯达唑的药理作用及其在动物生产中应用的研究进展[J].中国兽药杂志,2019, 53(5):67-73.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81972190); 陆军军医大学第二附属医院青年博士人才孵化计划(2022YQB012);

文章来源:黄子祺,李彦奇,戴纪刚,等.芬苯达唑通过激活自噬抑制肺腺癌细胞增殖及侵袭､迁移能力[J].现代药物与临床,2024,39(07):1671-1680.