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液相色谱质谱法测定土壤中苯胺前处理的问题探讨

2024-10-30 111 上传者：管理员

摘要：液相色谱质谱法测定土壤中苯胺具有溶剂用量少，定量分析灵敏度高，检出限低等优点，但样品的前处理过程正确与否直接影响苯胺测定的准确性。针对土壤监测中苯胺前处理过程中遇到的问题，本文讨论了内标加入时机和加入量、提取方式的选择、pH值调节、净化步骤溶剂用量、浓缩条件等关键环节对苯胺结果的影响，并提出解决方案。通过研究，希望能够对HJ1210-2021的测定效率提升提供帮助。

关键词：
前处理
土壤
土壤监测
苯胺
黏土矿物
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苯胺(C6H7N)属于半挥发性有机物，为无色油状液体，是最重要的胺类物质之一[1]。作为重要的化工原料，苯胺被广泛应用于农药、染料、树脂及橡胶硫化促进剂等工业生产中，本身也可作为黑色染料使用。由于苯胺可引起急性中毒，导致高铁血红蛋白血症和肝、肾及皮肤损害，长期低浓度接触可引起中毒性肝病[2]，世界卫生组织国际癌症研究机构将苯胺列入3类致癌物清单中。随着以苯胺为原料的相关化工行业产品产量不断扩大[1]，不可避免会造成大量苯胺等随废水进入空气、土壤和水体中。我国国标《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB36600-2018)中规定了苯胺的筛选值和管制值，对其加以严格管控。

由于土壤样品含有有机质、金属氧化物和黏土矿物等物质[3]，基质较为复杂，且土壤中的苯胺极易氧化，因此在测试前样品必须经过前处理，但样品前处理过程繁琐，耗时长，且以手工操作为主，前处理过程若出现问题，会出现假阳性、精密度差、回收率不稳定等现象，样品复测又需重新进行前处理过程，极大的影响苯胺测定的准确性及工作效率。笔者采用液相色谱质谱法，结合自身在检测土壤中苯胺的经验，分析前处理过程中提取、净化、浓缩等方面对苯胺测定结果的影响，并提出解决方案，以期对土壤中苯胺测定效率和准确性的提升提供帮助。

1、基本原理

土壤样品在碱性条件下，以正己烷-丙酮(1∶1)混合溶剂为提取液经提取，净化、浓缩、定容后，用液相色谱-三重四级杆质谱仪分离检测。液相色谱-三重四级杆质谱法是一种检出限低，定量分析灵敏的检测方法。样品通过溶剂梯度洗脱经色谱柱进行分离，分离后的化合物经过电离形成离子，经质量分析器选择特征离子实现目标化合物的测定。本方法取样量及溶剂用量少，能测定土壤中痕量苯胺类物质。检测单位可根据本单位仪器设备的配置情况进行相应的选择，并根据具体仪器配置进行条件优化。

2、前处理过程的问题及解决方案

2.1 内标物加入的时机与加入量

内标物是待测组分的同位素，在样品前处理、色谱分离及质谱检测的全过程中与待测组分具有相似行为，受基质效应的影响也一致[4]。由于本方法采用的是内标法定量，这就要求加入内标物的量一定要恒定，否则会引起较大的计算误差。因此在样品萃取前加入内标，可真实反映苯胺的含量。罗火焰等[5]验证了在样品浓缩前的提取步骤中加入内标，目标物回收率提高明显。HJ 1210中，标准溶液的内标物浓度为50μg/L，甲醇比例为25%。为了使样品的内标浓度与甲醇比例与标准溶液保持一致，在萃取前需加入含量为1μg的苯胺-d5内标液，上机的样品中内标物浓度才能达到50μg/L，实验时可根据实际购买到的内标物储备液浓度配置合适浓度中间液，保证加入含量为1μg即可。

2.2 提取方式对苯胺回收率的影响

在样品提取方面，针对苯胺类化合物常用的提取方式有快速溶剂萃取(ASE)及超声波提取法，两者均有比较广泛的应用。丁波涛等[6]采用ASE提取土壤中苯胺、丙烯腈、联苯胺和丙烯酰胺，平均加标回收率在86.5%～104.2%；丁炜炜等[7]采用超声提取土壤中15种苯胺类化合物，加标回收率在75.0%～121%。笔者同时采用ASE和超声两种方式对空白加标样品和土壤样品进行提取，分别称取5.0 g石英砂和土壤样品，加入正己烷-丙酮(1∶1,V/V)混合溶剂作为提取剂，加入1 g五水合硫代硫酸钠，100μL 25%氨水，目标物和内标物，ASE采用萃取压力为10 MPa，静态萃取时间5 min，炉温100℃，萃取循环次数为2次，氮气吹扫60 s。超声采用80 kHz超声提取30 min(水浴温度始终低于25℃)，4000 r/min离心10 min。分别对提取液进行净化、浓缩后上机测试，结果见图1。

图1 超声提取与ASE提取的空白与土壤样品回收率

由图1可知，采用超声提取的空白样品加标回收率和土壤样品加标回收率分别比ASE提取高出44%和19%，分析原因可能是因为苯胺易受萃取温度影响所致。ASE提取方式是在高温下将待测物质从土壤中转移至溶剂中，苯胺由于热不稳定容易氧化降解，造成回收率偏低。陶云峰、郭春焕、廖礼祥等[8-10]研究人员对ASE萃取温度进行了试验，发现当超过一定温度后，萃取效率反而下降，说明待测组分存在挥发损失。超声提取的优势在于提取过程一直处于低温状态，减少了不耐热组分在提取过程中的损失，同时与ASE相比，超声提取溶剂用量少，提取溶剂的浓缩倍数和浓缩时长相应也有所减少，这就减少浓缩过程可能产生的损失。因此，试验选择超声提取的方式提取土壤中苯胺。

2.3 pH值对回收率的影响

在实验过程中发现，实际样品在不添加氨水的情况下，超声结束后会产生乳化现象，生成絮状白色沉淀，离心后虽然溶剂和沉淀被分离开，在检测实际样品加标回收率时，加标回收率不足60%。分析回收率偏低的原因，一是正己烷-丙酮(1∶1)萃取体系呈弱酸性，pH值为5.65[4]，苯胺部分离子化，进入萃取溶剂较困难；二是产生的沉淀中可能富集着部分苯胺物质；三是提取液不是全量转移净化。苯胺为弱碱性物质，在碱性条件下萃取效率较高，因此在提取环节中加入氨水，一方面可与Ag+、Cu2+、Cr3+、Zn2+等离子发生络合反应，使样品不易产生沉淀；另一方面加入氨水后，萃取体系成碱性，苯胺主要以分子形态存在，更易进入萃取相[11]，加标回收率提高明显。李和平等[2]通过测试基体加标回收率发现，加入氨水后的苯胺回收率增加了59.57%。

2.4 水分对苯胺测定的影响

苯胺可溶解于水和有机溶剂中，两者的溶解度不同，实验中发现，若试样在前处理过程中含水，则会导致加标回收率偏低，因此在试样制备前将体系内的水分除净是十分有必要的。前处理过程中存在水分的情况有三点，第一是样品中含水。虽然样品经过制备已是干样，但水分去除仍不彻底，干物质含量无法达到100%；第二是抗氧化剂含水。实验使用的抗氧化剂为五水合硫代硫酸钠，在提取步骤中加入会使提取液中含水；第三是氮吹浓缩条件不当。氮吹浓缩是一个吸热过程，温度过低会导致浓缩瓶内外壁产生水分进入浓缩液中。综合以上三点，通过验证后设计的解决方案为：一是在活化萃取小柱前加入约1 g无水硫酸钠将提取液中的水分除净；二是在氮吹过程中，控制加热温度在40℃左右，防止大量吸热在管壁形成水滴。

2.5 净化步骤溶剂加入量的选择

净化是指用化学或物理的方法除去提取物中对测定有干扰的杂质的过程[12]。净化是样品前处理中十分重要的环节，当用有机溶剂提取样品时，一些干扰杂质可能与待测物一起被提取出，这些杂质若不除掉将会影响目标物的电离，影响质谱检测准确性，严重时还可使色谱柱柱效减低、检测器沾污，因而提取液必须经过净化处理。有机样品净化常选用固相萃取方法(SPE)，常见的净化柱有硅酸镁柱(Florisil)、硅胶柱(Si)、HLB柱、石墨化炭黑柱(Carb)和C18柱等类型。参照标准，采用C18柱作为净化柱开展实验。实验过程中发现，不同品牌规格C18柱结果差距较大，可能是萃取柱在使用前吸附了其他物质，仅使用5 mL二氯甲烷无法将萃取柱淋洗干净。为了测试出合适的淋洗液体积，分别使用二氯甲烷对C18柱进行冲洗一次(5 mL)、二次(10 mL)和三次(15 mL)，再分别用甲醇冲洗一次(5 mL)、二次(10 mL)和三次(15 mL)平衡萃取柱，对比样品加标回收率，结果见图2。

图2 二氯甲烷和甲醇不同用量活化萃取柱后的回收率

由图2可知，使用相同品牌规格的C18固相萃取柱净化样品提取液时，使用5 mL二氯甲烷冲洗，5 mL甲醇平衡萃取柱的样品加标回收率仅有63%，随着甲醇冲洗次数的增加，样品加标回收率提升至96%。使用15 mL二氯甲烷冲洗，5 mL甲醇平衡C18柱的回收率仅有25%，可能是有二氯甲烷残留，甲醇洗脱不完全所致。随着二氯甲烷和甲醇冲洗萃取柱的体积增加，样品的加标回收率逐渐提高。因此实验采用15 m L二氯甲烷分三次加入，确保萃取柱得到充分的淋洗和活化，再用15 mL甲醇分三次加入，平衡萃取柱，确保甲醇能完整地置换出二氯甲烷。经验证，采用此溶剂用量样品加标回收率可满足标准中65%～130%的要求。

2.6 固相萃取柱的选择

实际检测过程中还发现，空白试样和样品数值存在检出的现象，通过逐一排除各个试剂发现，问题出现在C18柱上，因此选择市售不同品牌规格C18柱开展空白比对。C18柱规格见表1，结果见图3。

表1 不同品牌C18萃取柱型号规格

图3 不同品牌规格C18柱的空白响应值

由图3可知，A、C和D品牌结果差异不大，500 mg/6 mL与1 g/6 mL规格的结果接近。B品牌的两款C18柱空白响应值分别达到了104和105数量级，说明C18柱中的表面活性吸附剂存在杂质，对实验产生了严重的正干扰。因此，购买的固相萃取柱在使用前，必须进行空白试验进行验收，检验C18柱的净化能力，确保实验室空白测定结果低于方法检出限，方能使用。

2.7 氮吹浓缩的条件

选用氮吹仪进行浓缩时，一般可调节氮气流速和温度，实现目标物快速准确高效地浓缩。试验在不同温度下，同一样品的回收率，测试温度分别为30℃、40℃和50℃。结果表明，温度的提升除了在浓缩时间上稍有减少，加标回收率并没有显著提升。因此，氮吹仪的温度并不是影响苯胺回收率的主要条件。氮吹浓缩时，溶剂吸热，此时若氮吹速度过快可能导致浓缩管中形成水滴进入浓缩液中影响目标物的测定。过快的氮吹速度还会使溶剂蒸发过快导致目标物及内标物不同程度的损失，这与李婧等[13]的研究结论一致。因此，流速控制在溶剂表面有细微波动或者轻微凹陷为宜。氮吹过程中还发现，个别样品在氮吹时产生了白色絮状物，可能与土壤本身基质、净化小柱有流出物等因素有关，因此，样品在上机前，必须经过聚四氟乙烯滤膜过滤，以免堵塞色谱柱。

3、结论

样品前处理过程的细节，决定了监测数据的准确性。本文结合笔者在实际检测土壤中苯胺遇到的问题进行研究和探讨，并对比了超声提取和ASE提取两种方式的优缺点，结论如下：

(1)内标物应在提取步骤加入，与待测目标物的全过程测定保持一致，减少计算误差，加入量应保持恒定。

(2)由于高温会导致苯胺氧化、挥发，因此在低温环境下采用超声提取方式，苯胺的损失更小。

(3)苯胺属于弱碱性物质，在碱性萃取体系中萃取效率高，在萃取前应加入氨水调整萃取体系为碱性，防止产生沉淀，提高加标回收率。

(4)萃取液在净化前可经无水硫酸钠脱水。

(5)固相萃取柱在使用前应开展空白试验，确保其不受影响测定的杂质干扰方可使用。净化时，使用15 m L二氯甲烷分三次冲洗，15 m L甲醇平衡萃取柱，苯胺加标回收率可达96%。

调整氮吹仪的加热温度为40℃，防止氮吹过程产生水分进入溶剂中；控制氮吹流量至溶剂表面有细微波动或轻微凹陷，减少目标物和内标在浓缩过程中的损失。

文章来源:王思思.液相色谱质谱法测定土壤中苯胺前处理的问题探讨[J].广东化工,2024,51(20):162-164.