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结直肠癌蛋白质组学分析及其应用

2024-10-21 97 上传者：管理员

摘要：目的基于LC-MS/MS非标记定量蛋白质组学分析结直肠癌(colorectal cancer, CRC)差异蛋白并筛选与CRC发生相关的关键通路。方法采用LC-MS/MS对3例CRC患者肿瘤组织和癌旁正常组织的蛋白质组进行定量分析，筛选差异蛋白。通过生物信息学分析筛选与CRC发生发展密切相关的候选蛋白并验证。通过TCGA分析筛选CRC潜在标志物。结果蛋白质组学分析共鉴定了4 257个蛋白，差异蛋白544个，显著上调蛋白446个，显著下调蛋白98个。基于GO富集分析及KEGG通路分析，发现与RNA和DNA功能相关的蛋白通过调控基因表达和细胞增殖参与了CRC的发生发展。基于此筛选RNA功能相关差异蛋白为候选蛋白：PRPF19、HNRNPM、UTP18、RCL1、RPL3、EIF5、NCBP2、NOP58、RANBP2,随后在另外5例CRC患者肿瘤组织和癌旁组织上进行了表达验证。成功验证出NCBP2、PRPF19、HNRNPM在CRC中表达显著增加，且NCBP2表达水平与患者总体生存率呈负相关。结论本研究筛选了在CRC发生发展过程中具有潜在重要作用的3个差异蛋白，有望作为CRC诊断和治疗的靶标。

关键词：
NCBP2
定量蛋白质组学
消化道
生物标志物
结直肠癌
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的发生于结直肠部位的消化道恶性肿瘤。在全世界，每年约有上百万人确诊为CRC,其是最为常见的恶性肿瘤之一[1]。由于CRC早期无明显症状，且缺乏有效的诊断方法，因此，大多数患者确诊时已经处于中晚期，延误了最佳治疗时期，导致CRC死亡率居高不下[2]。但是，目前尚缺乏特异性和灵敏度均较高的生物标志物[3]。因此亟需发展CRC特异性生物标志物，用于CRC早期筛查，促进CRC的预防和治疗。

蛋白质组学技术作为一种高通量、无偏差的蛋白质分析策略，已经在肿瘤生物标志物和疾病靶点筛选中广泛应用[4]。虽然，已有多项研究通过蛋白质组学技术鉴定出CRC患者血清、肿瘤组织中的蛋白表达变化[5-6]。但由于蛋白质组学分析方法和组学数据质量的问题，现今仍未筛选出有效的标志物。

本研究对CRC患者的癌和癌旁组织进行了基于LC-MS/MS非标记定量蛋白质组学分析，鉴定肿瘤组织中显著改变的蛋白和相关生物学功能，筛选出与CRC发生显著相关的关键通路，为CRC疾病标志物和治疗靶点研究奠定实验基础。

1、资料与方法

1.1结肠癌样本收集

本项研究收集了8例2020年1月至2021年1月苏州大学附属第一医院CRC术后标本，年龄(45.3±6.72)岁(32～53岁),均为男性。癌旁组织为距离肿瘤>5 cm处的正常组织，样本提供者在样本采集前均签署了知情同意书。本研究经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准(批准号：IRB2020282)。

1.2仪器、试剂与材料

蛋白质组学分析采用LC-MS/MS,包括纳升液相色谱(EASY nL Thermo Scientific, USA)和四级杆超高分辨轨道阱质谱仪(Q Exactive-HF,Thermo Scientific, USA)。质谱级乙腈和甲酸购自阿拉丁公司(中国，上海),RIPA裂解液用于组织蛋白提取。BCA蛋白试剂盒(圣尔生物，中国，上海)用于蛋白浓度检测。测序级胰蛋白酶(Promega, USA)用于蛋白质酶解。

1.3方法

1.3.1蛋白质酶解：

取100μg RIPA提取总蛋白，加入5倍体积的100%丙酮，混匀后-20℃下过夜沉淀蛋白。将得到的蛋白质沉淀溶解于6 mol/L盐酸胍溶液中。加入终浓度20 mmol/L二硫苏糖醇，在60℃下还原60 min,然后加入终浓度100μmol/L吲哚-3-乙酸，避光处理40 min。将得到的蛋白质溶液转移到10 kDa超滤管中，并置换溶液成50 mmol/L NH4HCO3,按酶∶蛋白质=1∶50(质量比)的比例加入胰蛋白酶，在37℃下反应16 h,将蛋白质充分酶解成肽段。

1.3.2质谱分析与数据处理：

通过上述样品前处理获得的除盐肽段，通过液相色谱EASY-nLC 1000 Nano-Flow UHPLC与Q Exactive-HF Orbitrap质谱仪联用系统进行分析。所得质谱原始数据导入Maxquant(版本1.5.3.30)软件进行定量分析，非标记定量选择LFQ数据分析模式。选择在所有检测样本中均有效定量的蛋白，以表达量变化至少2倍差异且P<0.05为标准筛选差异蛋白。

1.3.3生物信息学分析：

对鉴定的蛋白进行基因注释分析(Gene Ontology),将差异蛋白列表上传Omicsbean(http: //www.omicsbean.com/)数据库，以分析蛋白质细胞成分、分子功能及其生物学过程。对于蛋白质相互作用分析网络及生物学过程分析，将差异表达的蛋白质列表上传Ingenuity Pathway Analysis软件进行聚类分析(IPA;QIAGEN,Redwood City, http: //www.ingenuity.com/)。

1.3.4蛋白免疫印迹：

分别取20μg蛋白使用10%SDS-PAGE电泳60 min,然后将蛋白转0.45μm PVDF膜上。PVDF膜用质量浓度为50 g/L脱脂奶粉室温下封闭60 min。一抗用5%BSA稀释后，4℃下孵育过夜，所用抗体均购自Proteintech Group(Proteintech, USA)。PBST洗膜三次后，加入二抗，二抗室温孵育60 min。PBST洗膜三次后，进行显色。

1.3.5实时定量荧光PCR:

使用TRIZOL法提取组织总RNA,操作按照说明书进行。取1μg总RNA进行反转录，使用诺唯赞试剂盒(R212-01)按照说明书进行。反转录后的cDNA稀释成10 ng/μL,取20 ng进行PCR反应，使用诺唯赞试剂盒(中国，南京)按照说明书进行。

1.4统计学分析

采用Grahpad 8.3进行数据分析及绘图。两组连续变量间的比较采用Student’st检验。总体生存采用Mantel-Cox进行假设检验，包含Cox比例风险比和95%CI,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CRC差异表达蛋白鉴定与筛选

本次研究对CRC患者的肿瘤组织及癌旁组织通过LC-MS/MS非标记定量蛋白质组学技术进行定量分析，共鉴定出4 257个蛋白。主成分分析结果表明，肿瘤组和正常组蛋白表达有显著的区别(见图1A)。差异蛋白544个，其中显著上调蛋白446个，显著下调蛋白98个(见图1B～1C)。按照FC数值排名得到的上、下调前10位的差异蛋白见表1。

2.2差异蛋白的GO功能富集与KEGG通路富集分析

对差异蛋白进行GO富集分析结果表明，差异蛋白主要富集于细胞核和细胞器中(见图2A)。生物学过程分析显著富集于蛋白翻译、基因表达、核糖体生成、细胞增殖、RNA加工、细胞周期和代谢过程(见图2B)。分子功能富集结果表明，差异蛋白具有核酸结合、RNA结合、大分子复合体结合、酶结合、细胞黏附分子结合的功能(见图2C)。KEGG通路富集分析发现，差异蛋白显著富集于剪切体、核糖体生成、RNA转运、DNA复制、蛋白酶体相关信号通路(见图2D)。

图1 CRC差异蛋白筛选

表1 CRC显著上调、下调差异蛋白(排名前10)

图2差异蛋白GO分析与KEGG分析

2.3差异蛋白互作网络分析

通过STING我们进一步构建了差异蛋白互作网络(见图3A),其中与RNA功能相关的模块显著聚类，包括核糖体合成、RNA转运、剪切体组成(见图3B)。

图3差异蛋白互作网络分析

2.4差异蛋白的验证

我们接着挑选了9个与RNA功能直接关联的差异蛋白为候选蛋白，包括：Pre-mRNA-processing factor 19(PRPF19)、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M(HNRNPM)、U3 small nucleolar RNA-associated protein 18(UTP18)、RNA 3′-terminal phosphate cyclase-like protein(RCL1)、60S ribosomal protein L3(RPL3)、Eukaryotic translation initiation factor 5(EIF5)、Nuclear cap-binding protein subunit 2(NCBP2)、Nucleolar protein 58(NOP58)、E3 SUMO-protein ligase RanBP2(RANBP2)在mRNA水平上进行了表达验证。在另外收集的5例CRC患者肿瘤和癌旁正常组织样本中进行qPCR表达分析。结果表明：与正常组相比，PRPF19、HNRNPM、UTP18、RCL1、NCBP2在肿瘤组织中表达显著升高(见图4A)。我们进一步通过TCGA数据库分析以上5个基因在CRC样本库中的表达情况，发现与正常组相比(n=349),HNRNPM、NCBP2、PRPF19在CRC肿瘤中(n=275)显著增加(见图4B～4D)。

图4候选蛋白验证

2.5预后标志物的筛选

Western blotting检测结果表明，与正常组织相比，HNRNPM、NCBP2、PRPF19在肿瘤组织中表达显著升高(P<0.05,见图5A)。GEPIA基于基因表达进行总体生存分析，使用Mantel-Cox进行假设检验，我们发现NCBP2表达水平与CRC总生存率有显著相关性，NCBP2高表达会显著降低患者总生存率(P<0.05,见图5B),而HNRNPM和PRPF19表达水平与CRC患者总生存率无相关性(见图5C～5D)。

图5 CRC预后标志物的筛选

3、讨论

CRC在我国发病率呈逐年上升趋势，根据最新统计数据显示，我国CRC发病率在所有恶性肿瘤中居第四位，每年的新发病例为(30～40)万，且呈现年轻化趋势[2]。Siegel等[7]统计发现，晚期CRC 5年相对生存率仅14%,而早期CRC的生存率高达90%。因此，探寻CRC的诊断靶标及治疗靶点对扭转CRC的病程、提高生存率具有重要的意义。

本研究中，我们通过蛋白质组学分析CRC患者肿瘤组织中蛋白表达的变化，共鉴定出4 257个蛋白，其中较正常结肠组织具有显著差异改变的蛋白有544个。进一步通过生物学过程分析提示这些差异表达蛋白主要富集于蛋白翻译、基因表达、核糖体生成、细胞增殖、RNA加工、细胞周期及代谢过程，而这些生物学过程均与细胞增殖过程密切相关[8]。众所周知，癌细胞的最大特征就是具有不受控制的细胞增殖能力[9]。因此，结合此次差异蛋白生物学过程分析，同时也表明了组学数据的高可信度。分子功能富集结果随后表明差异蛋白在核酸结合和RNA结合上显著富集。核酸结合蛋白主要包括转录因子和RNA结合蛋白，它们在调控细胞增殖、基因表达中发挥了举足轻重的作用[10-11]。以上结果提示，与核酸结合的蛋白通过调控基因表达和细胞增殖参与了CRC的发生发展。同时，KEGG通路富集与差异蛋白互作网络进一步阐明了RNA功能相关蛋白在调控CRC中发挥着重要作用。

为此，我们在544个差异蛋白中挑选了9个与RNA功能直接关联的蛋白在5例CRC患者肿瘤组织及TCGA数据库进行了验证，结果表明HNRNPM、NCBP2、PRPF19这三个蛋白在CRC中显著增加，随后的生存分析提示NCBP2表达水平与CRC总生存率呈负相关。已知NCBP2是mRNA帽结合复合物(cap-binding complex, CBC)的成分，它与mRNA前体的5’端结合，参与各种过程，如前体mRNA剪接、翻译调节、无义介导的mRNA降解等[12-14]。CBC还通过其与SRRT/ARS2的相互作用参与miRNA的生成，是miRNA介导的RNA干扰所必需的[15]。有研究发现，NCBP2在头颈部鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌中表达升高，且与疾病预后相关[16-17]。目前，NCBP2在CRC中的功能研究尚未报道，我们的研究通过定量蛋白质组学技术，筛选并验证了与CRC发生发展相关的蛋白NCBP2,并分析了其与CRC的临床相关性。我们的研究表明，NCBP2在CRC中表达显著增加，且表达水平与患者总体生存率呈负相关，可作为CRC预后潜在标志物。

综上所述，本文借助蛋白质组学技术对CRC组织的蛋白质组进行了研究，通过定量比较CRC和癌旁组织的蛋白表达差异，发现与RNA和DNA功能相关的蛋白通过调控基因表达和细胞增殖参与了CRC的发生发展。基于此筛选并验证出了3个具有潜在重要作用的蛋白HNRNPM、NCBP2和PRPF19,并且发现RNA结合蛋白NCBP2表达水平与患者总体生存率负相关，有望作为CRC诊断和治疗的靶标。

参考文献:

[2]孙可欣,郑荣寿,张思维,等.2015年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2019,28(1):1-11

文章来源:贾振宇,钱丽娟,夏婷婷.结直肠癌蛋白质组学分析及其应用[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(10):1323-1328.