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支架置入治疗小鼠原位结直肠癌模型所致结肠狭窄的实验研究

2024-05-09 43 上传者：管理员

摘要：目的:探索小鼠原位结直肠癌(colorectal cancer, CRC)模型中结肠支架置入的方法与价值。方法:6～8周龄BALB/c雌性裸鼠20只，接受内窥镜引导下小鼠结肠黏膜下人结肠癌HCT-116细胞注射。结肠肿瘤形成后，选取肿瘤大小达到4级的15只小鼠作为实验模型，进行支架放置，观察支架置入后小鼠结肠肿瘤及肠腔变化。结果:利用小动物内窥镜行结肠黏膜注射肿瘤细胞建立小鼠结肠癌模型的技术成功率为100%,结肠腔内肿瘤形成率为95%。肿瘤大小达到4级需要12～16天(中位时间14天)。所有小鼠的支架置入技术成功率为100%。支架置入后结肠肠腔内肿瘤受压肠腔通畅，肿瘤呈现为1级，一周后肿瘤快速增殖沿支架网眼向肠腔内生长，导致肠腔再次狭窄。结论:通过小鼠原位CRC模型的支架置入可以完美地模拟人类CRC梗阻支架置入后再狭窄的过程，为研究肿瘤支架置入后肠腔再狭窄的机制奠定了基础。

关键词：
原位结直肠癌模型
小鼠内窥镜
支架置入治疗
结肠支架
肠梗阻
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结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的恶性肿瘤之一，其全球每年发病超过130万例[1]。据报道有20%的CRC患者会并发肠梗阻，主要原因为结直肠肿瘤向管腔内生长造成管腔狭窄所致[2]。虽然CRC的临床治疗有所进展，但是发生梗阻的患者预后仍然很差，这类患者的死亡率高达15%～20%[2,3]。

作为一种治疗方法，自膨胀金属支架已显示出其疗效，并已被建议用于治疗结直肠梗阻以避免紧急手术，特别是对于那些“无法治愈的患者”可作为一种姑息性的解决方案[4,5,6]。接受结直肠支架置入的患者术后护理时间较短且承受较少的医疗费用负担。另一方面，支架置入可作为CRC所致结肠梗阻患者术前治疗的“手术桥梁”。支架置入不仅可以降低肠道压力，还可为接下来的手术治疗作肠道准备。结直肠支架置入作为一种姑息性治疗的替代方式，已在临床中迅速获得广泛接受[7]。

为了避免支架发生迁移，临床上使用最多的支架是裸支架，尤其是用于姑息治疗的患者。许多类型的肠内支架正在研发中，以扩大临床应用的范围[8,9]。但是对于CRC支架置入后管腔再狭窄的研究较少，有必要进行深入的基础研究探讨其发生机制，为实施创新性治疗打下良好的基础。

本研究通过小动物内窥镜引导，行小鼠肠黏膜注射肿瘤细胞[10]。待肿瘤形成后，在透视引导下进行支架置入以观察管腔再狭窄情况，可有效再现CRC梗阻后支架置入前后变化，现汇报如下。

1、材料与方法

1.1 小鼠术前准备

将20只6～8周龄BALB/c雌性裸鼠于无特定病原体(specific pathogen free, SPF)、24 ℃、昼夜各12 h条件下饲养，自由进饮进食，遵守实验动物保护法并经伦理委员会审批。

1.2 内窥镜系统

我们使用高分辨率小动物视频内窥镜系统(Karl Storz, 德国蔡司公司),包括带有工作通道的微型内窥镜(范围 1.9 mm 外径)、冷光源、三芯片摄像头、监视器和气泵。

1.3 肿瘤细胞置入程序

操作程序简述如下：正如赵晓辉等人[10]所报道，将小鼠仰卧放在加热垫上，麻醉小鼠并进行清肠，30 G的注射针配合内窥镜，在内镜的监视下缓慢进针穿刺肠壁。当穿刺针进入结肠黏膜下后，将体积为50 μL(包含细胞数为3×105)的人结肠癌细胞HCT-116细胞注入结肠黏膜下层(图1)。注射后，将针头保持在气泡中至少10秒，然后退出穿刺针，缓慢后退内窥镜，将小鼠放回笼子中，待小鼠苏醒后送返动物饲养房。

1.4 内镜分级评分

肿瘤大小分级如下：1级(非常小但可观察到的肿瘤),2级(肿瘤占肠腔面积的1/8),3级(肿瘤占肠腔面积的1/4),4级(肿瘤占肠腔面积的1/4～1/2)和5级(肿瘤占肠腔面积的1/2以上)。在HCT-116细胞注射后的第2、7、12和16天对所有小鼠进行内镜随访，通过内镜进行分级评分(图2-5)。在第3次和第4次随访中，如果肿瘤大小等级达到4级，选取15只建模成功的小鼠作为下一步支架置入实验的理想模型，剩余的小鼠将被处死(颈椎脱臼法)行病理学检查了解肿瘤种植情况。

图1 内镜监视下细针细胞注射(蓝箭头：细针)

图2 1级肿瘤形成

图3 2级肿瘤形成

图4 4级肿瘤形成

图5 5级肿瘤形成

1.5 支架直径的选择

为了确定使用支架的直径，我们对小鼠不同状态下的结肠直径进行测试和测量。第一步，我们测量正常的离体结肠直径为2.5 mm。然后，我们夹住结肠的一端并从肛门注入PBS以填充结肠，测得直径为3.5 mm。最后，我们根据测量结果选择了支架直径。考虑到支架移位的可能，我们选择了直径4 mm的支架，以尽可能避免支架移位的发生。

1.6 支架置入程序

将小鼠置于平卧位，置于加热垫上，用2.0%异氟醚持续麻醉小鼠。将灌肠针插入肛门注射对比剂碘海醇进行结肠造影。肿瘤的位置在结肠造影图像中显示为充盈缺损(图6A)。此后，用16号针鞘作为支架输送系统，并通过肛门插入。在透视引导下，16号包含压缩支架的针鞘通过结肠狭窄处。支架在充盈缺损的位置处释放，覆盖结肠肿瘤(图6B)。术后，进行结肠造影检查支架的位置和肠道通畅性(图6C)。

1.7 内镜随访

为评价支架置入后的效果，结肠支架置入术后第1天立即行内镜复查肠腔肿瘤及支架情况(图7),随后在第4天和第7天进行结肠镜检查了解肠腔支架及肿瘤情况。

2、结果

20只BALB/c雌性裸鼠在内镜引导下进行HCT-116细胞注射，19只有肿瘤形成。选取在第3次和第4次内镜评估中肿瘤评分达到4级的15只小鼠作为支架置入实验的小鼠模型，行支架置入术。所有小鼠的支架置入技术成功率为100%。支架置入后，所有15只小鼠的肿瘤大小评分从4级降为1级。在支架置入后一周的随访中，共有3只小鼠因结肠梗阻死亡，1只小鼠死于结肠穿孔。1周时内镜随访可见肿瘤快速生长，内窥镜图像显示支架网眼内肿瘤过度生长或向内生长。根据肿瘤分级评分，在支架置入后1周，肿瘤评分由1级上升至2级或3级(图8)。4只建模成功但肿瘤评分未达到4级的小鼠行病理学检查发现所有肿瘤均位于结肠黏膜下，无腹腔肿瘤种植或形成。

病理：通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE staining)的小鼠肠壁组织学切片确认结直肠肿瘤位于黏膜下(图9)。

图6 支架置入程序

图7 结肠支架置入术后第1天

图8 结肠支架置入术后第7天

图9 位于黏膜下层和肌层之间的肿瘤组织学图像(×400)

3、讨论

本研究采用内镜引导下对小鼠结肠黏膜行肿瘤细胞注射，结肠肿瘤形成率达到95%(19/20)。病理显示所有肿瘤均位于黏膜下层，未出现肿瘤外源性生长。这需要有熟练的技术操作以及对内窥镜检查设备和针头非常熟悉。另一方面，向小鼠结肠黏膜下注射细胞的剂量也很重要，50 μL的细胞悬液量比较适中，既可以保障肿瘤形成，也不会因为注射量过大造成肿瘤细胞外漏。最后，轻柔的穿刺结肠黏膜并在拔针前停留10秒可避免细胞渗漏[11]。

研究显示，小鼠结肠肿瘤在支架置入后仍然快速生长，1周左右肿瘤沿支架网眼向肠腔内生长，完美地模拟了人体结肠癌支架置入后的再狭窄过程。根据肿瘤分级评分，1周后由1级增至2级或3级。这意味着支架可以暂时压迫肿瘤，但并不能阻止肿瘤再次快速生长[12]或者说支架对肿瘤没有治疗作用。因此，开发出同时具有治疗肿瘤作用的支架将是我们下一步的工作目标。

在一周的随访期间内，共有4只小鼠死亡。最常见的死亡原因是结肠梗阻(3/4),正如之前在人类研究中所报道的那样，支架置入后再次梗阻是延迟并发症，且发生率高达25%[13]。肿瘤过度生长或向内生长是支架置入后再梗阻的主要原因，通常发生在长期支架治疗的过程中[14]。在我们的研究中，所有的结肠梗阻均发生在支架置入后1周左右。有两种可能的原因导致支架置入后的再梗阻。第一个是支架置入改变或减少了支架处肠管的运动能力，粪便因失去推动力而难以通过支架。在这种情况下，粪便会停留在支架入口处，并最终导致在支架置入后的早期发生梗阻。第二个原因是肿瘤的过度生长会再次阻塞肠腔造成肠腔狭窄，因此导致粪便排出困难。本研究中出现1只小鼠因结肠穿孔而死亡，解剖发现支架末端与肠壁摩擦造成肠壁破裂，支架突出于肠腔之外形成肠穿孔，最终导致小鼠感染死亡。

虽然在临床工作中尚不明确理想支架直径为多少，但实际临床工作中使用的原则是结肠支架的直径通常比结肠管腔直径大2 mm或10%,且长度应超过狭窄边缘5～10 mm[15]。在动物研究中，鲜有描述小鼠结肠支架尺寸大小的报道。我们测量了小鼠正常结肠和充满水的结肠的直径。在正常情况下，结肠直径约为2.5 mm。但是对于充满水的结肠，管腔直径达到了3.5 mm。因此，我们选择了直径4 mm, 长度8 mm的支架作为本研究的理想支架。但是在出现了3例肠梗阻后我们认为直径4 mm, 长度8 mm的支架对于小鼠来说过大，可能会造成肠道蠕动障碍，因此，需要进一步缩小支架的直径和长度进行测试。

支架迁移是一种常见的并发症，据报道，在临床研究中使用覆膜支架时的迁移率高达30%至50%,使用裸支架时迁移率高达12%[14,16]。此外还有报道称，使用一种喇叭形的大直径支架可以降低迁移率，但它会增加如穿孔等其他并发症发生的风险。我们研究的15只小鼠都没有发生支架迁移，这可能是因为我们所使用的支架直径大到足以支持结肠腔并抵抗迁移。因此，临床应用中应该在支架直径和并发症之间取得一种平衡。另一方面，根据我们的研究，没有迁移可能意味着4 mm直径的结肠支架对于小鼠来说稍大。

综上所述，对于小鼠结肠癌所致的管腔狭窄应用结肠自膨胀金属支架可以使因肿瘤生长而梗阻的管腔再度通畅。但不加以后续的治疗措施容易出现肿瘤过度生长、内向生长，并且很快将发生再次梗阻。如果辅以其他治疗措施如抗肿瘤药物治疗、肿瘤激光照射热疗等能否克服单纯支架置入后肠管短时间内再狭窄的缺点，帮助支架长时间保持管腔畅通有待进一步研究。

参考文献:

[6]王刚,毕聪,潘鑫.DSA引导下自膨式金属支架治疗晚期左半结肠癌合并急性肠梗阻的临床分析[J].现代肿瘤医学,2020,28(12):2075-2079.

[10]赵晓辉,胡鸿涛,黎海亮,等.经小动物内窥镜行肠黏膜下注射肿瘤细胞建立原位结直肠癌模型的技术探讨[J].现代肿瘤医学,2022,30(20):3639-3643.

基金资助:河南省自然科学基金面上项目(编号:212300410403);河南省医学教育研究项目(编号:Wjlx2021334);

文章来源:朱文博,黎海亮,赵晓辉,等.支架置入治疗小鼠原位结直肠癌模型所致结肠狭窄的实验研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(11):1963-1967.