结直肠癌现已成为世界上第三大常见的癌症，同时也是世界上癌症相关死亡的第二大癌症[1]。国家癌症中心最新的统计结果表明2000—2016年间我国结直肠癌的发病率与死亡率呈明显上升趋势[2],这也意味着我国的结直肠癌负担正在不断加重[3]。结直肠癌患者早期往往无明显症状，确诊时往往已到达中晚期，约有20%的病人在确诊时已经出现了远处转移，另有25%的局限性疾病患者随后会发生转移[4]。为即时诊断与治疗结直肠癌，美国癌症协会建议个体在45岁的时候开始进行结肠镜筛查[5],此外一些新的生物学标志物也有可能帮助诊断与治疗[6];尽管如此，结直肠癌的总体预后仍不理想，尤其是转移性结直肠癌。

miRNA是一种由18～24个核苷酸组成的短链非编码RNA,其可以通过靶向特定的关键基因而发挥作用[7],已被研究发现在多种癌症中存在差异表达与参与癌症进展[8],被认为可能作为癌症诊断或预后的标志物[9],也被认为是潜在的治疗药物或治疗药物靶点[10]。miR-590-5p来源于miR-590家族，位于人染色体7q11.23,其在不同肿瘤中通过不同的作用机制而发挥着相对复杂的生理作用[11]。已有研究表明，miR-590-5p可以促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖[12]与促进胰腺癌细胞迁移[13];而在非小细胞肺癌[14]与恶性黑色素瘤中[15]却又抑制了肿瘤的发生与发展。miR-590-5p在结直肠癌中的作用目前仍尚未完全明确，因此本研究尝试研究miR-590-5p在结直肠癌中的临床意义，以及miR-59-5p对结肠癌细胞的作用及可能的分子机制。

一、材料与方法

1.临床标本：

选择2022年6月—2023年12月本院收治的进行手术的结直肠癌患者纳入研究，共收集到40对结直肠癌组织与癌旁组织样本。所有样本在取得后均立即编号保存于液氮中，癌旁组织样本取样时均距癌组织边缘大于5 cm。纳入标准：(1)患者均未在术前接受过针对癌症的放疗、化疗或其他治疗手段；(2)癌组织样本均得到病理学验证为结直肠癌；(3)患者及家属同意参与本次研究。本研究通过了上海市奉贤区中心医院伦理委员会的审核(伦审号：2023-KY-17-01)。

2.细胞与主要试剂、仪器：

人胚肾细胞HEK293与人结肠癌细胞系HCT116、SW480、SW620、LoVo均购置于中国上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、DMEM培养基、Opti-MEM培养基与胰酶均购置于美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline, PBS)、100×青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin, PS)购置于安徽合肥Biosharp公司；miR-590-5p模拟物(5’-GAGCUUAUUCAUAAAAGUGCAG-3’)及阴性对照(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)、miR-590-5p抑制剂(5’-CUGCACUUUUAUGAAUAAGCUC-3’)及其阴性对照(5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)均由中国上海GenePharma公司设计合成；Lipofectamine 3000、TRIzol试剂均购置于美国Invitrogen公司；qPCR中所使用的引物均由安徽滁州通用生物公司合成；qPCR使用的miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)和miRNA Universial SYBR qPCR Master Mix试剂盒购置于江苏南京诺唯赞生物科技公司；qPCR使用的Evo M-MLV RT Mix with gDNA clean for qPCR和SYBR®Green Premix Pro TaqHS qPCR购置于湖南长沙艾科瑞生物工程公司；CCK-8试剂盒购置于美国APE×BIO公司；Transwell小室与matrigel基质胶购置于美国Corning公司；SMAD7基因报告质粒野生型(WT)与突变型(Mut)均由江苏南京Geneppl公司设计合成；Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒购置于美国Promega公司；RIPA细胞裂解液与蛋白酶抑制剂购置于江苏苏州新赛美生物科技公司；抗SMAD7抗体购置于湖北武汉Proteintech公司；抗GAPDH抗体购置于美国Abclonal公司。

3.方法：

(1)提取组织样本RNA与qPCR分析：将40对结直肠癌组织与癌旁组织样本取一小块充分研磨，使用TRIzol试剂提取组织样本中的总RNA,再使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)和miRNA Universial SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行qPCR实验，以U6作为内参基因，分析比较结直肠癌组织与癌旁组织中miR-590-5p的表达差异，结合患者的相关临床信息进一步分析结直肠癌中miR-590-5p表达差异与临床特征之间的关系。(2)细胞系和细胞培养：在37℃,5% CO2的加湿恒温培养箱中，使用含10% FBS,1% PS的DMEM完全培养基培养HEK293、HCT116、SW480、SW620与LoVo细胞。(3)细胞转染：将miR-590-5p模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及各自的阴性对照(mimics NC、inhibitor NC),依据Lipofectamine 3000的说明书操作，分别转染到SW480与HCT116细胞中，转染结束后继续培养48～72 h,以用于后续试验。(4)细胞RNA提取与qPCR:运用TRIzol试剂提取未处理的结肠癌细胞或转染48 h后的结肠癌细胞系的总RNA,同组织样本RNA进行处理，以U6作为内参基因分析miR-590-5p的表达水平；使用Evo M-MLV RT Mix with gDNA clean for qPCR和SYBR®Green Premix Pro TaqHS qPCR进行qPCR,以GAPDH为内参基因分析SMAD7的相对表达情况。最后通过2-△△Ct对目标基因的表达情况进行归一化计算处理。所用到的引物序列见表1。(5)细胞增殖：通过CCK-8实验检测结肠癌细胞增殖。细胞转染48 h,收集细胞并计数，向96孔板每孔加入100μl(3×103个细胞)细胞悬液。培养至24 h、48 h、72 h、96 h时，添加10μl的CCK-8溶液到对应的孔中，在恒温培养箱中避光培养1 h,通过全波长酶标仪检测450 nm处的吸光度。(6)细胞迁移与侵袭：通过Transwell实验检测结肠癌细胞迁移与侵袭。细胞转染48 h,用不含FBS的DMEM培养基收集细胞，将细胞悬液稀释至5×105个细胞/ml。向小室上腔加入200μl细胞悬液，小室下方沿孔壁加入700μl含20% FBS的DMEM培养基。培养48 h后，将小室依次润洗，固定，染色与静置干燥，于显微镜下随机选取5个视野对到达小室下方的细胞拍照。进行侵袭实验时，将matrigel基质胶解冻后，用DMEM培养基1︰40稀释，取100μl覆盖小室上部后培养箱中静置2 h。向小室上方加入400μl细胞悬液，下方加入900μl的含20% FBS的DMEM培养基，余步骤同迁移。(7)细胞共转染与双荧光素酶报告实验：Targetscan数据库(www.targetscan.org/vert_80/)筛选靶基因SMAD7,以pmir-GLO作为质粒载体，我们设计得到了SMAD7的报告基因质粒野生型与突变型。将报告基因质粒与miR-590-5p模拟物或阴性对照使用Lipofectamine 3000共转染到HEK293细胞中，共转染体系为2μg报告基因质粒100 pM模拟物或阴性对照5μl Lipofectamine 3000。24 h后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒处理细胞，使用微孔板型多功能检测仪依次检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性。结果显示为萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。(8)细胞总蛋白提取与western blot:转染72 h,用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用10%SDS-PAGE凝胶分离适量的蛋白质，电泳完成后进行转膜与5%脱脂牛奶封闭。封闭结束后将相应条带的NC膜分别与抗SMAD7和抗GAPDH的一级抗体于4℃摇床孵育过夜。次日，将NC膜与二抗室温下孵育2 h,接着用显影液孵育后于化学发光成像分析仪下显影拍照。

4.统计学处理：

应用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，Graphpad Prism 9.5软件作图，计量数据用

表示，用Student's t检验比较两个独立组之间的差异，使用方差分析比较多组或多变量之间的统计学差异，使用χ2检验分析结直肠癌组织中miR-590-5p表达差异与临床特征之间的相关性。P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01认为差异有显著统计学意义。

图1结直肠癌组织中miR-590-5p的表达情况

二、结果

1.miR-590-5p在结直肠癌组织中的临床意义：

通过qPCR检测40对结直肠癌组织中miR-590-5p的表达。总体水平上，miR-590-5p的表达在癌组织与癌旁组织间无明显差异(如图1A,P>0.05)。个体水平上，存在15对癌组织较癌旁组织miR-590-5p表达升高(如图1B,P<0.05),余下25例癌组织中miR-590-5p表达水平下降(如图1C,P<0.05)或无差异(如图1D,P>0.05)。进一步结合临床特征分析后，本研究发现miR-590-5p的表达水平与患者的肿瘤分期(见表2,P<0.05)、神经脉管的侵犯(见表2,P<0.05)和淋巴结转移数目(见表2,P<0.01)正相关；也就是说，在进展期结直肠癌、神经脉管侵犯的结直肠癌以及出现局部淋巴结转移的结直肠癌中的miR-590-5p表达水平常常升高。

2.miR-590-5p在体外促进结肠癌细胞的增殖：

通过qPCR检测4种结肠癌细胞中miR-590-5p表达水平，本研究发现在HCT116中相对表达最高，在SW480中相对最低(如图2A)。基于此，本研究选取这两个细胞系进行后续的体外功能实验，即将miR-590-5p模拟物与阴性对照转染到SW480细胞，以及将miR-590-5p抑制剂及其阴性对照转染到HCT116细胞中。随后的qPCR实验结果表明，转染模拟物后实现了SW480细胞中的miR-590-5p过表达(如图2B,P<0.05),转染抑制剂也成功抑制了HCT116细胞中的miR-590-5p的表达水平(如图2C,P<0.05)。接着，我们通过CCK-8实验验证了miR-590-5p对结肠癌细胞增殖的影响。结果表明，SW480细胞过表达miR-590-5p后的增殖能力显著增强(如图2E),而抑制miR-590-5p表达后，HCT116细胞增殖减弱(如图2F)。以上结果提示miR-590-5p可以在体外促进结肠癌细胞的增殖。

3.miR-590-5p在体外促进结肠癌细胞的迁移与侵袭：

由于SW480细胞的迁移能力较弱，所以本研究选用了HCT116细胞进行Transwell实验检测miR-590-5p对结肠癌细胞的迁移与侵袭的影响。HCT116细胞转染miR-590-5p模拟物后，也实现了miR-590-5p的过表达(如图2D,P<0.05)。Transwell实验结果表明，在HCT116细胞提高miR-590-5p的表达后会使得迁移细胞数与侵袭细胞数目较阴性对照组增多(如图3A～C),而抑制HCT116细胞中的miR-590-5p表达后，细胞的迁移能力与侵袭能力也会受到抑制(如图3D～F)。以上结果提示miR-590-5p可以在体外促进结肠癌细胞的迁移与侵袭能力。

4.SMAD7是miR-590-5p的一个靶基因，二者负相关：

通过生物信息数据库，本研究发现miR-590-5p与SMAD7 3’UTR端存在结合位点(如图4A),并设计合成了Smad7 3’UTR的野生型与突变型报告基因质粒。为进行双荧光素酶实验将其与miR-590-5p模拟物或阴性对照共转染到HEK293细胞。实验结果表明相较于突变型与模拟物共转染组，野生型与模拟物共转染后萤火虫荧光素酶活性显著降低(如图4B,P<0.01),表明miR-590-5p与SMAD7 3’UTR可以靶向结合。进一步通过qPCR和western blot检测miR-590-5p对结肠癌细胞中SMAD7在RNA和蛋白质水平的影响。结果表明提高miR-590-5p表达会抑制SMAD7在SW480细胞中RNA(如图4C,P<0.05)和蛋白质(如图4E,P<0.05)的表达；而抑制miR-590-5p表达后，HCT116细胞中SMAD7的表达在RNA(如图4D,P<0.05)和蛋白质水平(如图4F,P<0.05)上则会有一定程度提升。以上结果提示SMAD7是miR-590-5p的一个潜在靶基因，二者呈现负相关的关系。

图2miR-590-5p对结肠癌细胞增殖的影响

表1引物序列

图3miR-590-5p对结肠癌细胞迁移与侵袭的影响

图4miR-590-5p与SMAD7的靶向结合关系

3、讨论

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，传统治疗手段仍然具有一定的局限性，其治疗效果与预后情况仍未达到人们的预期。免疫治疗的兴起，有助于改善这一情况的同时，也意味着需要更多更好的诊断标志物与治疗靶点。miRNA本身不编码蛋白质，但是却可以通过不同的作用机制影响多种细胞生物学功能，毫无疑问地成为了一个潜在的良好的肿瘤诊断与治疗的靶点。据估计，在人体内miRNA调控着近三分之一的蛋白质编码基因表达[16],其不仅是表观遗传学的靶点，也是表观遗传学修饰因子的调节因子[17]。在个体发育、细胞分化、胚胎发生、代谢、器官发生与凋亡等生物学过程中，miRNA均会发挥作用[18]。miR-590-5p来源于miR-590家族，已被研究发现在不同的肿瘤中通过靶向不同的靶基因而发挥多种生物学功能，其在一些肿瘤中的差异表达，也使其成为肿瘤诊断的潜在生物标志物[19-20]。

本研究首先发现miR-590-5p在结直肠癌组织与癌旁组织中表达情况无明显差异。进一步结合患者的临床与病理特征分析后，本研究发现：尽管miR-590-5p的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤位置无明显相关性，但却与患者的肿瘤分期、神经脉管侵犯情况和淋巴结转移数目存在正相关关系，据此推测miR-590-5p在结直肠癌中特别是转移性或晚期结直肠癌中可能发挥着积极的作用。因此，本研究围绕miR-590-5p对结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭的影响及可能的机制来设计展开。我们的体外实验结果显示过表达miR-590-5p可以促进结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭，而抑制其表达后，结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力则会受到抑制。综合以上结果，我们认为miR-590-5p在结肠癌细胞中可能发挥着促进结肠癌细胞进展的作用。

表240对结直肠癌组织中miR-590-5p的表达水平与临床特征的相关性(n)

为了进一步探讨miR-590-5p在结肠癌细胞中发挥作用的可能机制，本研究通过数据库筛选发现SMAD7 3’UTR端与miR-590-5p存在结合位点。基于此，本研究设计进行了双荧光素酶基因报告实验，结果表明，SMAD7与miR-590-5p确实存在靶向结合关系，这也与之前的研究结果保持一致[21-22]。本研究还通过qPCR和western blot检测了miR-590-5p对结肠癌细胞中SMAD7表达的影响，发现miR-590-5p可以在RNA水平与蛋白质水平上抑制SMAD7的表达，表明二者呈负相关关系。由于SMAD7是TGFβ信号的关键负调控因子之一，其可以通过结合TGFβR1并阻止后续的Smad2/3磷酸化[23-24]、将磷酸酶募集到TGFβR1上使其去磷酸化[25]等作用机制抑制TGFβ/SMAD信号通路活性，而TGFβ/SMAD信号通路又在肿瘤的发生与发展中起着十分重要的作用[26]。已有研究发现多种因素可以介导TGFβ/SMAD信号通路从而影响结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭等功能[27-28]。此外，也有研究报道miRNA可以通过靶向SMAD7促进肿瘤的发生与发展[29-30],这与本研究的研究结果相一致，因此，本研究认为miR-590-5p可以通过靶向SMAD7进而影响TGFβ/SMAD信号通路的表达实现促进结肠癌细胞的进展。

综上所述，本研究表明，miR-590-5p在结直肠癌特别是进展期结直肠癌中发挥着积极的作用，同时本研究的发现也为miR-590-5p未来在结直肠癌的诊断、生物标志物、靶向治疗与预后判断等方面提供了一次有益的探索。当然，本研究也存在一定的局限性，比如临床组织样本量偏少；没有设计体内实验来验证miR-590-5p在体内对结肠癌的影响等，后续也将进一步设计实验予以完善及验证。

基金资助:上海市奉贤区科技发展基金(20201301);

文章来源:朱忠林,张光军.miR-590-5p靶向SMAD7促进结肠癌细胞进展的机制研究[J].齐齐哈尔医学院学报,2024,45(15):1401-1407.