食管癌是原发于食管，好发于食管中段的恶性肿瘤，在中老年男性人群中易发病，患者表现为进行性的吞咽困难，疾病诱因包括但不限于吸烟饮酒过量、饮食温度过高、常食腌制食物。早期治疗预后良好，但其易发生转移，侵犯邻近器官，错失治疗窗口期，预后较差[1,2]。我国食管癌发病率占所有肿瘤发病的第6位，死亡率为第4位[3]。因此，探讨食管癌的生物学机制以丰富新的治疗靶点对于食管癌的治疗有现实意义。长链非编码RNA(lncRNA)不编码蛋白，但其参与细胞的增殖、迁移、侵袭等多种生理病理生物学过程。脑细胞质RNA(BCYRN)1是一种lncRNA,在食管癌患者癌组织中显著上调，且与患者预后呈正相关[4]。lncRNA可通过海绵吸附大量miRNA干扰其干涉靶基因mRNA编码蛋白能力。miR-627-3p是在骨肉瘤[5]、结肠癌[6]、口腔癌[7]等多种癌中表达异常的基因，但其在食管癌中还未见研究。生信网站分析，BCYRN1与miR-627-3p存在靶向关系，推测BCYRN1可能通过调控miR-627-3p参与食管癌的发展。因此，本研究主要探究BCYRN1对食管癌细胞迁移与侵袭的影响，并初步探讨其影响细胞迁移、侵袭的相关机制，为丰富食管癌的靶向治疗库提供依据。

1、材料与方法

1.1 主要细胞系及试剂

人食管癌细胞TE-1(bio-73172)、Eca-109(bio-73018)、TE-11(bio-73395)、NEC(bio-73349)及正常人食管上皮细胞系HET-1A(bio-73494)均购自北京百欧博伟生物技术有限公司；miR-627-3p mimics及其阴性对照mimics NC、miR-627-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor NC、si-BCYRN1及其阴性对照(si-NC)均购自上海拓然生物科技有限公司；DMEM培养基(A4192101)、LipofectamineTM2000转染试剂盒(11668019)、反转录试剂盒(K1691)、电化学发光(ECL)试剂(32209)、miRNA荧光定量检测试剂盒(R11490)均购自赛默飞世尔；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(P0012S)、CCK-8试剂盒(C0037)购自上海碧云天；E-钙黏蛋白(Cadherin, GTX100443)、N-Cadherin(GTX127345)、波形蛋白(Vimentin, GTX100619)、GAPDH(GTX124502)一抗均购自GeneTex; 山羊抗兔二抗(ab6721)购自美国abcam公司。

1.2 临床样本收集

2016年8月至2018年8月在遵义市第一人民医院行手术治疗的食管癌患者85例，取其手术过程中的癌组织及相对应的癌旁组织，患者术前均未接受放疗、化疗或其他形式的治疗。临床样本采集经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.3 实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测临床样本及细胞系lncRNA BCYRN1、miR-627-3p水平

常规培养食管癌TE-1、Eca-109、TE-11、NEC及正常食管上皮细胞HET-1A,提取食管癌组织、癌旁组织、TE-1、Eca-109、TE-11、NEC、HET-1A细胞系中总RNA,参照逆转录试剂盒说明说将适量RNA反转录为cDNA,参照miRNA荧光定量检测试剂盒说明书进行各项操作。PCR仪进行反应：95 ℃ 5 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 共41个循环。BCYRN1、miR-627-3p分别以GAPDH、U6为内参，引物由上海生工合成。使用2-ΔΔCt算法计算各组织、各细胞系lncRNA BCYRN1、miR-627-3p相对表达。引物序列(5′-3′):lncRNA BCYRN1正向引物CTGGGCAATATAGCGAGAC,反向TGCTTTGAGGGAAGTTACG;GAPDH正向引物CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC,反向ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC;miR-627-3p正向引物CACTCATCTTTTCTTTG,反向GAGTCTCTTGAGAGTACAT;U6正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA,反向ACGCTTCACGAATTTGC。

1.4 细胞分组

取对数生长期的NEC细胞，利用LipofectamineTM2000转染试剂盒对细胞进行转染，将细胞分为：空白组(未转染的NEC细胞)、si-NC组(转染si-NC)、si-BCYRN1组(转染si-BCYRN1)、mimics-NC组(转染mimics-NC)、miR-627-3p mimics组(转染miR-627-3p mimics)、si-BCYRN1+inhibitor-NC组(共转染si-BCYRN1和inhibitor-NC)、si-BCYRN1+miR-627-3p inhibitor组(共转染si-BCYRN1和miR-627-3p inhibitor)。使用qRT-PCR法检测各组lncRNA BCYRN1、miR-627-3p表达，方法参照1.3。

1.5 细胞增殖能力检测

按照分组情况将细胞(1×104/孔)接种于96孔板中，在每孔(培养0、24、48 h时)中添加CCK-8 溶液(10 μl)。室温孵育2 h后，450 nm处检测光密度(OD)值。

1.6 细胞迁移与侵袭能力检测

通过Transwell小室法对各组NEC细胞侵袭、迁移能力进行检测。侵袭实验：在Transwell小室中加入基质胶，37 ℃下固化(3 h),加入5×104个经DMEM培养基中重悬的NEC细胞。在下室中加入500 μl DMEM培养基，培养箱中孵育(48 h),NEC细胞经多聚甲醛固定(4%)并通过结晶紫(0.1%)染色，利用光学显微镜观察(随机挑选5个视野)。迁移试验中不加入基质胶，其余步骤参照侵袭试验。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

利用DIANA-LncBase v.2数据库预测lncRNA BCYRN1、miR-627-3p结合位点。构建BCYRN1 3'非翻译区(UTR)的野生型(WT-BCYRN1)和突变型(MUT-BCYRN1)质粒，并将其分别与mimics-NC、miR-627-3p mimics共转染至NEC细胞，转染48 h后，检测荧光素酶活性。

1.8 Western印迹检测蛋白质表达

提取各组NEC细胞总蛋白，BCA试剂盒对总蛋白进行定量。取适量蛋白质样品上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂牛奶(5%)封闭，加一抗E-Cadherin(1∶1 000)、N-Cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶5 000)、GAPDH(作为内参，1∶5 000),4 ℃下孵育过夜，Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)洗膜3次，添加辣根过氧化物酶(HPR)耦联的山羊抗兔二抗(1∶5 000),室温孵育2 h。利用ImageJ软件对蛋白的灰度值进行分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行t检验及SNK-q检验。

2、结果

2.1 lncRNA BCYRN1、miR-627-3p在食管癌组织、癌旁组织及各细胞系中的表达

与癌旁组织比较，食管癌组织中lncRNA BCYRN1表达水平显著升高，miR-627-3p表达水平显著降低(P<0.05);与人正常食管上皮细胞HET-1A相比，食管癌TE-1、Eca-109、TE-11、NEC细胞中lncRNA BCYRN1表达水平显著升高，miR-627-3p表达水平显著降低(P<0.05),其中NEC细胞中lncRNA BCYRN1表达水平最高，miR-627-3p表达水平最低(P<0.05),见表1。因此，后续研究选用NEC细胞。

与HET-1A细胞相比：1)P<0.05

表1 lncRNA BCYRN1、miR-627-3p在食管癌组织及细胞中的表达

2.2 沉默BCYRN1抑制NEC细胞增殖、迁移与侵袭

与空白组、si-NC组比较，si-BCYRN1组NEC细胞中BCYRN1表达水平、OD450值(24、48 h)、迁移及侵袭细胞数目、N-Cadherin、Vimentin表达显著降低，E-Cadherin表达显著升高(P<0.05),见图1、表2、图2。

2.3 过表达miR-627-3p抑制NEC细胞增殖、迁移与侵袭

与空白组、mimics-NC组比较，miR-627-3p mimics组NEC细胞中miR-627-3p、E-Cadherin表达水平明显升高，OD450值(24、48 h)、迁移及侵袭细胞数目、N-Cadherin、Vimentin表达显著降低(P<0.05),见图3、表3、图4。

图1 各组NEC细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

与空白组相比：1)P<0.05;与si-NC组相比：2)P<0.05

表2 沉默BCYRN1对NEC细胞增殖、迁移与侵袭的影响

图2 Western印迹检测3组细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达

2.4 BCYRN1靶向调控miR-627-3p

DIANA-LncBase v.2软件预测发现BCYRN1与miR-627-3p存在结合位点，见图5。与 mimics-NC+WT-BCYRN1组(1.12±0.14)相比，miR-627-3p mimics+WT-BCYRN1组细胞荧光素酶相对活性(0.33±0.02)明显降低(P<0.05);与mimics-NC+MUT-BCYRN1组(1.08±0.11)比较，miR-627-3p mimics+MUT-BCYRN1组细胞荧光素酶活性(1.15±0.13)无显著性差异(P>0.05)。qRT-PCR显示，与空白组(1.02±0.16)、si-NC组(0.99±0.16)比较，si-BCYRN1组NEC细胞中miR-338-3p表达水平(3.06±0.51)显著升高(P<0.05)。

图3 Transwell检测各组细胞迁移与侵袭(结晶紫染色，×200)

与空白组相比：1)P<0.05;与mimics-NC组相比：2)P<0.05

表3 miR-627-3p过表达对NEC细胞增殖、迁移与侵袭的影响

图4 Western印迹检测6组细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin表达

1～6:空白组、mimics-NC组、miR-627-3p mimics组、si-BCYRN1组、inhibitor-NC组、miR-627-3p inhibitor组

2.5 下调miR-627-3p表达减弱了沉默BCYRN1对NEC细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用

与si-BCYRN1组、si-BCYRN1+inhibitor-NC组相比，si-BCYRN1+inhibitor-NC组NEC细胞OD450值(24、48 h)、迁移及侵袭细胞数目、N-Cadherin、Vimentin表达显著升高，miR-627-3p、E-Cadherin表达显著降低(P<0.05),见图3、图4、表4。

图5 BCYRN1与miR-627-3p结合位点

表4 下调miR-627-3p表达对si-BCYRN1抑制NEC细胞增殖、迁移、侵袭的影响

3、讨论

食管癌是严重威胁患者健康的疾病，治疗靶点的研究是现有的研究热点。诸多证据显示，多种lncRNA在食管癌的疾病进展中发挥作用，如敲低lncRNA锌指蛋白反义链(ZFAS)1可显著抑制食管癌细胞增殖[8];lncRNA AL158206.1通过调控miR-340-5p/ADP核糖基化样因子(ARL)4C轴抑制食管癌细胞的增殖与迁移[9]。BCYRN1是一种lncRNA,研究显示，其在包括食管癌在内的多种肿瘤组织中异常表达。Hao等[10]研究显示，BCYRN1在胃癌患者癌组织样本中显著高于癌旁组织，其表达与患者晚期TNM分期、肿瘤大小正相关，沉默BCYRN1表达可抑制胃癌AGS细胞增殖、诱导G1/G0周期阻滞，增加细胞凋亡并削弱AGS细胞迁移。朱彩华等[4]研究显示，BCYRN1在食管癌组织中表达显著上调，且其高表达可缩短患者无进展生存时间与总生存时间，可能是接受根治术治疗的食管癌患者的不良预后指标。与相关研究结果相似；因NEC细胞中lncRNA唐氏综合征细胞黏附分子反义(BCYRN1)表达相对最高，故选择对NEC细胞进行沉默处理，发现沉默BCYRN1可抑制NEC细胞增殖、迁移与侵袭，提示BCYRN1在食管癌中发挥着癌基因的作用，抑制BCYRN1表达可能是潜在的食管癌治疗方式之一。

miR-627-3p在多中类型癌症中发生促癌基因或抑癌基因作用，如在结直肠癌FOLFIRI方案耐药患者血清中miR-627-3p表达显著高于非方案耐药患者[11];在皮肤鳞状细胞癌中miR-627-3p受LncRNA唐氏综合征细胞黏附分子反义(DSCAM-AS1)靶向下调促进皮肤鳞癌细胞SCC13、A431、HSC-5细胞增殖、迁移侵袭能力[12]。产生这种在各类型中表达不一致的现象可能原因为miR-627-3p是具有组织特异性的。本研究结果提示，miR-627-3p在食管癌中发挥抑癌基因作用。LncRNAs通过海绵化吸附miRNAs发挥作用，已被公认为LncRNAs介导恶性肿瘤发展的发病机制。本研究经DIANA-LncBase v.2软件分析发现，BCYRN1与miR-627-3p存在结合位点，沉默BCYRN1表达后miR-627-3p水平升高，猜测下调BCYRN1可能靶向miR-627-3p发挥抑癌作用。为验证此猜想，本研究在沉默BCYRN1基础上进一步下调miR-627-3p表达，结果提示沉默BCYRN1对NEC细胞恶性生物学进程的抑制作用可能是通过促进miR-627-3p表达发挥作用的。

上皮间质转化(EMT)在恶性肿瘤细胞的侵袭迁移中发挥关键作用，被认为是肿瘤侵袭、迁移的早期阶段[13]。肿瘤的浸润与远处转移涉及多步骤，EMT上皮样肿瘤细胞逐渐丢失细胞间的连接作用导致细胞形态改变并获得运动能力，促使上皮细胞逐渐转化为间质性细胞[14,15]。E-Cadherin主要存在于上皮组织中，N-Cadherin主要表达于间质细胞中，E-Cadherin表达下调与N-Cadherin表达上调是细胞EMT的标志[16,17]。Vimentin主要分布于成纤维细胞等间质细胞中，在正常上皮细胞中几乎不表达，因此其高表达也可以算是细胞EMT的一个标志[18]。本研究结果提示，沉默BCYRN1与上调miR-627-3p表达均可抑制NEC细胞的EMT,且沉默BCYRN1可能是通过上调miR-627-3p发挥作用的。

综上，沉默BCYRN1可能通过上调miR-627-3p, 抑制食管癌NEC细胞增殖、迁移与侵袭。但本研究也存在一定不足，下一步将进行体内试验验证。

参考文献:

4朱彩华,曹新广,曹巍,等.BCYRN1表达上调与食管鳞癌患者预后差相关[J].医药论坛杂志,2016;37(2):4-8.

8唐金明,王文祥.lncRNA ZFAS1在食管癌中的作用及其机制[J].中国生物制品学杂志,2020;33(7):762-8.

9吴菁,蒋志勇,李奎生,等.lncRNA AL158206.1/miR-340-5p/ARL4C轴对食管癌增殖和迁移的调控作用[J].中国医药指南,2021;19(22):1-4.

11李佳璐.血清microRNA(miRNA)作为结直肠癌分子标志物的临床和机制研究[D].天津:天津医科大学,2015.

12王东,王强,王珍.LncRNA DSCAM-AS1通过靶向miR-627-3p调控皮肤鳞状细胞癌增殖,侵袭和迁移[J].医学分子生物学杂志,2021;18(1):46-52.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81761374);

文章来源:赵佳,王海伦,李曾,等.lncRNA BCYRN1靶向miR-627-3p影响食管癌细胞生物学行为[J].中国老年学杂志,2024,44(18):4469-4475.