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蛋白KRT7对子宫内膜癌细胞的生长、迁移的促进及其分子机制研究

2020-08-05 527 上传者：管理员

摘要：目的:筛选子宫内膜癌中具有临床意义的潜在药物靶点,并研究此靶点蛋白在子宫内膜癌发生发展中的功能。方法:通过临床数据库GEPIA找到在子宫内膜癌中高表达的蛋白,且进一步根据临床预后相关性(高表达预后差原则)筛选到具有临床意义的蛋白KRT7,通过siRNA介导敲低KRT7的表达,利用细胞增殖实验、克隆形成实验和划痕迁移实验验证KRT7在子宫内膜癌发生发展中的重要性,最后通过分析与KRT7共表达基因参与的信号通路,探索KRT7在子宫内膜癌中发挥功能的潜在分子机制。结果:KRT7在子宫内膜癌中显著高表达,且高表达的病人具有不良预后;敲低KRT7抑制子宫内膜癌细胞的生长增殖和迁移;KRT7可能通过氧化磷酸化途径和Hedgehog信号通路参与子宫内膜癌的发生发展。结论:KRT7可作为子宫内膜癌的潜在药物治疗靶点。

关键词：
KRT7
分子机制
子宫内膜癌
生长
药物靶点
迁移
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子宫内膜癌是一种起源于子宫内膜的肿瘤,是最常见的妇科肿瘤[1]。在2018年的全球癌症统计数据中显示每年有382 069例新发病例和89 929例死亡病例,居女性各肿瘤发病率第六,死亡率第十一[2],我国每年子宫内膜癌的新发病例数约为6.9万[3],并且以大约每年1%～2%的比例增长[4],根据临床病理学、免疫组织学和分子特征,子宫内膜癌可分为两大类,第一类主要为中低级子宫内膜样腺癌,约占所有病例的80%～85%,而第二类子宫内膜癌原型是浆液性癌,通常发生在老年患者身上,预后较差[5]。女性在被诊断为子宫内膜癌时为晚期或具有复发性,则预后不良,因此,研究治疗子宫内膜癌的新疗法就显得尤为迫切。随着现代研究方法及研究理念的不断发展,分子生物学在探索治疗肿瘤中发挥着越来越重要的作用,也为子宫内膜癌的发病机制、临床诊断及治疗提供新靶点。KRT7蛋白是角蛋白家族成员之一,它的结构主要包括Head结构域、Rod结构域和Tail结构域,目前已知报道KRT7在肾小管细胞、肾导管细胞、肾盂黏膜细胞和输尿管中均有表达[6],而我们的研究发现,KRT7除在上述细胞中表达之外,在子宫内膜癌细胞相比于子宫内膜正常细胞显著高表达。这提示了KRT7在子宫内膜癌中的重要性,因此,本研究首先系统筛选了子宫内膜癌中高表达的蛋白,同时结合临床预后,确定了KRT7在子宫内膜癌进程中的重要性,再结合经典的分子生物学进行进一步的验证,这些研究都为KRT7作为子宫内膜癌的潜在药物治疗靶点提供了参考。

1、材料与方法

1.1细胞培养

人子宫内膜癌细胞HEC1A购于美国ATCC细胞库,培养在含10%胎牛血清的McCoy's 5a改良培养基中,并加入100μg/ml链霉素和100 IU/ml青霉素。细胞培养瓶置于含5%的CO2和95%湿度的37℃培养箱中。

1.2实验方法

1.2.1转染

以6孔板转染siRNA为例:将1μl siRNA与250μl Opti-MEM混匀,1μl lipo2000与250μl Opti-MEM混匀,室温放置5 min,然后将两部分合并,混匀,静置15 min,之后逐滴、均匀加入6孔板中的1个孔中。

以6孔板转染质粒为例:将2μg质粒与200μl Opti-MEM混匀,3μl PEI与200μl Opti-MEM混匀,将两部分合并,混匀,静置20 min,之后逐滴、均匀加入6孔板中的1个孔中。

1.2.2细胞增殖实验

消化长满10 cm盘的细胞,重悬于1 ml新鲜培养基中,用20μl可铺1个96孔板的密度铺细胞,每个实验组需3个生物重复,铺好所需的实验孔数。在5%CO2、37℃条件下孵育。细胞贴壁后即可转染siCTL、siKRT7#1、siKRT7#2。48 h后,开始测量吸光度。配制MTS反应液,按照MTS∶培养液=1∶20的比例配制反应液。每孔加入100μl MTS反应溶液,37℃继续培养。每隔半小时检测一次吸光度。将培养皿置摇床上低速振荡10 s以充分溶解结晶物。在490 nm处测量各孔的吸光值(A)。将每天的吸光值转换成代表每日细胞生长的参数,并绘制细胞增殖曲线。

1.2.3克隆形成实验

以6孔板细胞为例:每孔铺2 000个细胞,细胞贴壁后即可转染siCTL、siKRT7#1、siKRT7#2。每个样品做3个生物重复,待6～14天之后出现肉眼可见的克隆,收集细胞,用常温的PBS洗涤两次,用甲醇∶ 乙酸比为3∶1的固定液进行常温固定5 min,用含0.5%结晶紫的甲醇溶液常温固定15 min,水洗,直至背景紫色洗掉,室温晾干进行扫描,用10%醋酸溶液溶解结晶紫,并在A490测吸光度,绘制数据柱状图。

1.2.4划痕迁移实验

10 cm盘的1/4铺整个6孔板,待细胞贴壁后分别转染siCTL、siKRT7#1、siKRT7#2,待细胞长到90%用枪头在盘中央划痕,并用PBS洗一遍,拍摄0 h图片作为对照,之后每隔12 h进行拍摄观察。

1.2.5临床数据筛选

在临床数据库GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[7]中,通过tumor/normal>2找到在子宫内膜癌中高表达排名前10的蛋白,并通过LncAtlas数据库找到这10个重要蛋白与子宫内膜癌的临床预后相关性,从而筛选到目的蛋白。

1.2.6基因功能分析

在临床数据库cBioPortal[8,9]中找到与KRT7共表达的基因,将这些基因在DAVID和metascape中进行信号通路分析,从而为解析目的蛋白在癌症进程中发挥的功能提供参考。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,每个实验重复三次,数据采用表示,组间比较采用t检验或单因素方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1筛选具有临床意义的基因

通过临床数据库GEPIA找到所有在子宫内膜癌中高表达的基因,共有2 038个(图1A),箱式图显示对比正常组织,这2 038个基因确实在子宫内膜癌中高表达(图1B)。通过在子宫内膜癌组织中的表达量对比正常组织,找到差异最显著的前十个基因,分别是EPCAM、WFDC2、CLDN3、SLPI、SMIM22、SCGB2A1、KRT7、PRSS8、ELF3、CLDN4(图1C),一般认为这些基因是具有临床意义的基因,且具有成为临床药物靶点的潜力。

图1筛选子宫内膜癌中高表达的基因

2.2筛选具有临床意义且预后相关的基因

接着我们对比了这十个基因在子宫内膜癌中的表达(图2A),并结合在子宫内膜癌中的预后(图2B),找到了既在子宫内膜癌中高表达,且高表达预后差的具有临床意义的靶点KRT7,这些数据都暗示KRT7在子宫内膜癌发展进程中发挥着重要作用,且具有很强的临床应用价值,因此,本研究进行了细胞水平的验证。

图2筛选具有临床意义且预后相关的基因

2.3 KRT7对子宫内膜癌细胞增殖的影响

我们在子宫内膜癌模型细胞HEC1A中,通过两条不同的siRNA介导敲低KRT7蛋白的表达,同时转染siCTL作为对照,我们发现,在敲低KRT7蛋白的HEC1A细胞中(图3A),生长增殖速率显著降低(图3B),克隆形成实验也验证了上述实验结果(图3C),同时我们也在HEC1A细胞中过表达空载和KRT7(图3D),对比过表达空载的HEC1A细胞,过表达KRT7的细胞增殖速率显著加快(图3E),克隆形成实验也得到了验证(图3F),初步说明KRT7促进子宫内膜癌细胞的生长。

图3 KRT7对子宫内膜癌细胞增殖的影响

2.4 KRT7对子宫内膜癌细胞迁移的影响

为了进一步证明KRT7在子宫内膜癌发生发展中的重要性,我们进行了两条不同的siRNA介导敲低KRT7蛋白的划痕实验,发现在敲低KRT7蛋白的HEC1A细胞中,细胞迁移速率显著减慢(图4),这进一步证明了KRT7在子宫内膜癌中的重要性,上述的功能实验也暗示了KRT7可以作为子宫内膜癌的临床潜在药物靶点。

2.5初步探索KRT7促进子宫内膜癌发生发展的潜在分子机制

通常认为蛋白共表达的基因可参与相同信号通路发挥功能,因此我们在cBioPortal数据库中找到与KRT7正相关的617个基因、负相关的1 172个基因,通过KEGG和Hallmark信号通路分析,我们发现与KRT7正相关的基因暗示KRT7可能参与氧化磷酸化途径促进子宫内膜癌的发生发展(图5A和B),与KRT7负相关的基因暗示KRT7可能参与Hedgehog信号通路促进子宫内膜癌的发生发展(图5C和D),已有文献报道氧化磷酸化信号通路和Hedgehog信号通路在细胞内尤为重要,且与癌症发生发展密切相关。

图4 KRT7对子宫内膜癌细胞迁移的影响

图5探索KRT7参与子宫内膜癌发生发展的潜在分子机制

3、讨论

目前关于治疗子宫内膜癌的分子靶向抑制剂已有研究报道,如24%～39%的子宫内膜癌患者存在磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的异常激活,故PI3K/Akt/mTOR抑制剂被认为是一种很有前景的治疗子宫内膜癌的治疗方案[10],但磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂Pilaralisib有皮疹、腹泻和疲劳等不良反应[11]。Akt抑制剂Perifosine有良好的耐受性,但疗效欠佳[12]。mTOR抑制剂替西罗莫司可用于治疗子宫内膜癌,但疗效并不理想[13]。血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂贝伐单抗与VEGF结合促使所有亚型的VEGF灭活,从而抑制内皮细胞和肿瘤细胞的活化和增殖。贝伐单抗在子宫内膜癌中临床反应率很高[14],但也只能局部控制[15]。酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)可以维持癌细胞的扩散和存活,络氨酸激酶抑制剂索菲拉尼能够控制体外子宫内膜癌病变的进展[16,17],但还缺乏临床数据。表皮生长因子受体EGFR抑制剂由于药物反应率低,结果并不尽如人意[18]。人类表皮生长因子抑制剂曲妥珠单抗对于子宫内膜癌的抗肿瘤活性受限[19]。因此我们想通过临床数据筛选到更具临床意义的药物靶点,以求为子宫内膜癌的治疗提供新的策略。

本文系统的筛选了子宫内膜癌中具有临床治疗靶点潜力的蛋白,结合经典的分子生物学方法验证了KRT7在子宫内膜癌发生发展中的重要性,并初步探索了KRT7参与子宫内膜癌发生发展的潜在分子机制,但这些实验结果与结论仍需更深层次的验证,经典的分子生物学方法除细胞增殖、克隆形成以及划痕迁移实验外,可进一步通过个体水平(裸鼠成瘤或敲除性小鼠模型)实验进行验证,氧化磷酸化途径与Hedgehog信号通路都还停留在分析阶段,需要结合KRT7全转录组测序技术进行验证,同时可根据KRT7质谱组学找到与KRT7相互作用的蛋白藕合子,参考该蛋白耦合子在子宫内膜癌中的已有报道或者进一步通过细胞增殖、克隆形成、裸鼠成瘤等经典的生物学方法验证该耦合子在子宫内膜癌中的作用,同时探讨该耦合子是否参与氧化磷酸化途径或Hedgehog途径从而在子宫内膜癌中发挥重要作用,这样更深层次地阐释KRT7参与子宫内膜癌发生发展的机制。证实了KRT7在子宫内膜癌中的重要性,暗示了KRT7可作为治疗子宫内膜癌的潜在药物靶点,因此我们想针对其筛选具有药理学活性的小分子抑制剂,进一步推动临床子宫内膜癌的治疗进程。将KRT7蛋白进行体外表达,通过HPLC进行纯化,银染鉴定,将纯化后的蛋白培育结晶,进行晶体X射线衍射,对KRT7的结构进行解析,从而指导靶向KRT7的小分子抑制剂的设计,为临床治疗子宫内膜癌提供参考。

参考文献：

[3]孙可欣,郑荣寿,张思维,等.2015年中国分地区恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2019,28(01):1-11.

[17]陈阳,王丽,何静,等.索拉非尼对子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖､凋亡的影响[J].现代肿瘤医学,2016,24(18):2839-2841.

刘超坤,刘若男,王涛.KRT7促进子宫内膜癌细胞的生长､迁移及其分子机制探讨[J].现代肿瘤医学,2020,28(18):3123-3128.

基金:河南省自然科学基金资助项目(编号:2018201432)