首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤科职称论文 > 姜黄素对Wnt/β-Catenin信号通路活性及胰腺癌干细胞自我更新的影响分析

姜黄素对Wnt/β-Catenin信号通路活性及胰腺癌干细胞自我更新的影响分析

2020-08-24 303 上传者：管理员

摘要：目的:探讨姜黄素对胰腺癌干细胞自我更新及其Wnt/β-Catenin信号通路活性的影响。方法:(1)通过细胞球培养法获取Panc1胰腺癌干细胞。(2)通过MTT法检测姜黄素对Panc1胰腺癌干细胞自我更新能力的影响。通过实时定量PCR检测姜黄素对Panc1胰腺癌干细胞中Wnt1、β-Catenin、CyclinD1mRNA表达水平的影响。通过细胞免疫组化检测姜黄素对Panc1胰腺癌干细胞中β-Catenin蛋白表达的影响。结果:(1)Panc1胰腺癌细胞悬浮培养时全部细胞聚集成球状。(2)悬浮培养5天后得到的Panc1胰腺癌干细胞体外培养时，加入20μM姜黄素后，细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.01);细胞中Wnt1、β-Catenin、CyclinD1的mRNA转录水平明显下调，β-Catenin蛋白表达也明显下调，细胞质、细胞核均未见β-Catenin表达。结论:姜黄素可显著抑制胰腺癌干细胞自我更新，并可显著抑制其Wnt/β-Catenin信号通路活性，抑制该通路活性可能是姜黄素抑制胰腺癌干细胞自我更新的机制之一。

关键词：
Wnt/β-catenin信号通路
姜黄素
肿瘤干细胞
胰腺癌干细胞
自我更新
加入收藏

肿瘤干细胞在肿瘤细胞中只占极少数的比例，这些细胞表面表达干性标志物，具有干细胞特性，能够抵抗化疗和放疗，是肿瘤产生、复发和转移的根源，如何靶向杀伤这些肿瘤干细胞，是肿瘤治疗的关键问题。姜黄素(Curcumin)是姜科植物根茎中提取的化合物，具有广泛的抗肿瘤作用，研究证实姜黄素能够抑制胰腺癌细胞恶性表型[1,2]，在体内外抑制胰腺癌细胞的生长，并且与吉西他滨具有协同作用[1,2,3]。我们前期研究中，采用细胞球培养法获取胰腺癌干细胞，并鉴定其具有肿瘤干细胞特性，这些胰腺癌干细胞对传统化疗药物5氟尿嘧啶和吉西他滨抵抗，但对姜黄素敏感[4]。为了探明姜黄素对胰腺癌干细胞自我更新的影响及其分子机制，本研究在体外观察了姜黄素对胰腺癌干细胞自我更新的抑制作用，检测了姜黄素对胰腺癌干细胞Wnt/β-Catenin信号通路相关分子的影响。

1、材料与方法

1.1材料

Panc1胰腺癌细胞株，购买自上海中科院细胞研究所。DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27、青霉素、链霉素、胰蛋白酶(0.25%Trypsin/0.02%EDTA)，购自美国Invitrogen公司。CCK-8购自日本同仁公司。普通胰岛素购自诺和诺德中国制药有限公司。姜黄素购自美国Sigma公司。鼠抗人β-Catenin抗体、兔抗鼠IgG购自美国R&D公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人胰腺癌细胞株Panc1

培养于含10%FBS的DMEM培养基(含1%青、链霉素)，37℃、5%二氧化碳及饱和湿度条件下。

1.2.2细胞球悬浮培养

制备Panc1胰腺癌细胞的单细胞悬液，以2×105/mL的密度接种于超低吸附6孔培养板，培养于含20μg/LbFGF、20μg/LEGF、B27(150)、4μ/L胰岛素的DMEM/F12培养基(含1%青、链霉素)，37℃、5%二氧化碳及饱和湿度条件下，培养5～7天后收获细胞球，制备成单细胞悬液进行下一步实验。

1.2.3生长曲线采用含10%FBS的DMEM

培养基制备Panc1胰腺癌干细胞(悬浮培养5天获得的细胞球细胞)的单细胞悬液，接种于96孔板，5000个细胞/孔，每组设置3个复孔。设置空白对照组和姜黄素组，培养24小时后，空白对照组加入含10%FBS的DMEM培养基200μL，姜黄素组加入含20μM姜黄素和10%FBS的DMEM培养基200μL。继续培养24小时后，每天同一时间每组各取三孔细胞，通过MTT法(采用CCK8)在酶标仪450nm波长检测光密度值，连续5天，绘制生长曲线，观察姜黄素对Panc1胰腺癌干细胞增殖能力的影响。

1.2.4实时定量PCR

将Panc1胰腺癌干细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基，贴壁24小时后，空白组继续采用含10%FBS的DMEM培养基，姜黄素组采用含20μM姜黄素和10%FBS的DMEM培养基，继续培养48小时，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后进行实时定量PCR,Wnt1、β-Catenin、CyclinD1引物序列详见表1。实时定量PCR反应条件52℃2min,95℃，10min,95℃15s;57℃1min，共40个循环;95℃15s;60℃1min;95℃15s。

表1实时定量PCR引物序列

1.2.5细胞免疫组化

将Panc1胰腺癌干细胞接种于玻片上，分空白对照组和姜黄素组，贴壁24小时后，空白组继续采用含10%FBS的DMEM培养基，姜黄素组采用含20μM姜黄素和10%FBS的DMEM培养基，继续培养48小时，取出玻片，进行细胞免疫组化检测β-catenin的表达。

2、结果

2.1细胞球培养

Panc1普通胰腺癌细胞单细胞悬液接种于超低吸附6孔培养板悬浮培养后，全部细胞都悬浮集聚集成球状，见图1,5天后收获细胞球细胞用于下一步实验。

2.2生长曲线

体外培养的Panc1胰腺癌干细胞(悬浮培养5天获得的细胞球细胞)，在加入20μM姜黄素后，与对照组相比，细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.01)，见图2。

图1Panc1细胞球(×400倍)

图2生长曲线图

2.3实时定量PCR

体外培养的Panc1胰腺癌干细胞，在加入20μM姜黄素后，Wnt/β-Catenin信号通路成员Wnt1、β-Catenin、CyclinD1的mRNA转录水平明显下调，Panc1普通胰腺癌细胞的Wnt1、β-Catenin、CyclinD1的mRNA转录水平分别是Panc1胰腺癌干细胞的(16.162±2.106)倍、(5.235±0.106)倍、(1.598±0.095)倍，见图3。

图3Wnt1(A)、β-Catenin(B)和CyclinD1(C)mRNA表达水平

2.4细胞免疫组化

在体外培养的Panc1胰腺癌干细胞中，可见β-Catenin在部分细胞的细胞质中有弱表达，在部分细胞的细胞核中有较强表达，加入20μM姜黄素后，细胞质、细胞核均未见β-Catenin表达，提示β-Catenin表达水平明显下调，见图4。

图4β-Catenin蛋白表达(×200倍)

3、讨论

肿瘤细胞存在异质性，其中数量极少的肿瘤干细胞能够抵抗化疗、放疗，是肿瘤复发和转移的根源。近年来研究发现一些非传统的化疗药物能够杀伤肿瘤干细胞，其中包括姜黄素。姜黄素是一种多酚类物质，具有广泛的抗肿瘤作用。研究发现姜黄素可通过下调AKT和PI3K/Akt/NF-κB信号通路的活性抑制胰腺癌的发生和发展[1,2]，近期研究还发现姜黄素能够抑胶质瘤干细胞[5]、食管癌干细胞等肿瘤干细胞的自我更新，并可增加一些肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性[6]。但姜黄素对胰腺癌干细胞的作用及其机制尚未见研究报道。

本研究前期工作中，采用无血清含生长因子的干细胞培养基对人胰腺癌细胞株Panc1细胞进行悬浮培养，得到聚集的肿瘤细胞球，并证实这些肿瘤细胞球细胞具有肿瘤干细胞特性，包括体积小、核浆比大的干细胞样形态和结构，细胞表面表达干性标志物CD24,CD44,CD133,ESA和nestin，具有外排荧光染料Hoechst33342的能力，Hedgehog,Notch和Wnt/β-catenin等自我更新信号通路激活，而且这些胰腺癌干细胞对传统化疗药物吉西他滨和5氟尿嘧啶的抵抗性明显强于普通胰腺癌细胞，但是对姜黄素的敏感性又明显强于普通的胰腺癌细胞，说明姜黄素对胰腺癌干细胞的杀伤作用强于对普通胰腺癌细胞的杀伤作用[4]。本部分研究结果显示姜黄素对Panc1胰腺癌干细胞具有明显的生长抑制作用，为了探讨姜黄素对胰腺癌干细胞自我更新抑制的作用机制，我们检测了姜黄素对胰腺癌干细胞Wnt/β-Catenin信号通路相关分子的影响。Wnt/β-Catenin信号通路在胚胎发育和肿瘤形成中具有重要作用，在无Wnt信号导入时，β-Catenin能够顺利磷酸化，再通过泛素途径被降解，使胞质中的β-Catenin维持在较低的浓度，Wnt信号通路处于关闭状态。当Wnt糖蛋白与卷轴受体的结合后，β-Catenin磷酸化受阻，在胞浆中稳定的积聚，与Tcf-4结合形成复合物，穿梭入核内，启动靶基因转录，包括CyclinD1,C-myc,C-Myb和MMP-7等，这些靶基因在细胞增殖及癌变过程中起重要作用，过度表达时将影响细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生[7]。我们前期研究发现，胰腺癌干细胞中β-Catenin的mRNA水平显著高于普通胰腺癌细胞，而且普通胰腺癌细胞的β-Catenin定位在细胞膜，而胰腺癌干细胞的β-Catenin定位在胞核与胞质，提示胰腺癌干细胞的Wnt信号通路显著激活[4]。本部分研究结果显示，体外培养的Panc1胰腺癌干细胞，在加入姜黄素后，Wnt/β-Catenin信号通路成员Wnt1、β-Catenin和CyclinD1的mRNA转录水平明显下调，β-Catenin蛋白表达水平也明显下调，细胞质、细胞核均未见β-Catenin表达。Wnt1为β-Catenin信号通路的配体之一，而β-Catenin是该信号通路的关键成员，在胞浆中稳定的积聚，意味着该信号通路的激活，而CyclinD1是该信号通路的靶基因之一，过度表达将促进细胞的增殖和肿瘤发生。我们检测到姜黄素作用后，胰腺癌干细胞中Wnt1、β-Catenin、CyclinD1的mRNA转录水平明显下调和β-Catenin蛋白表达水平明显下调，提示Wnt/β-Catenin信号通路活性受到抑制。

上述研究结果显示，姜黄素可显著抑制胰腺癌干细胞自我更新，并且可抑制Wnt/β-Catenin信号通路活性，抑制该通路活性可能是姜黄素抑制胰腺癌干细胞自我更新的机制之一。本研究，在一定程度上明确了姜黄素对胰腺癌干细胞的杀伤作用及其机制，为临床上姜黄素与化疗药物联合治疗胰腺癌提供了实验依据，并有利于提供较为合理和有效的临床治疗策略。

宁晓燕,柳勤译,陈晓武,杨海云,许鸣.姜黄素对胰腺癌干细胞自我更新及其Wnt/β-Catenin信号通路活性的影响[J].黑龙江医药,2020,33(04):738-741.

基金:广东省中医药局科研项目(项目编号:20162004);广东省医学科学技术研究基金项目(项目编号:A2016442);2015年广东省第二人民医院引进人才科研启动基金项目