上皮性卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，大多数患者在确诊时已是晚期。铂类药物为主的化疗是目前的主要治疗方法。然而，约有30%的患者在接受一线治疗时会出现铂类药物耐药性。复发卵巢癌患者通常被分为铂耐药和铂敏感两种。即使是初始治疗后对铂类药物敏感的患者，随着多次复发和多线治疗，无铂间期会逐渐缩短乃至发生铂耐药。因此，迫切需要开发新的、有效的预后指标和治疗铂类耐药卵巢癌(PROC)的策略来改善预后。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度>200个核苷酸的RNA片段，在调控基因表达和正常生理过程等多方面都发挥着重要作用，其表达和功能失调是包括癌症在内多种疾病发生和发展的关键，充当诱饵、支架、竞争性内源性RNA[1]。越来越多的证据表明，lncRNA通过充当癌基因或肿瘤抑制因子，在癌症的发生和发展中发挥复杂而精确的调节作用[2]。益气活血解毒方是卢雯平教授针对气虚血瘀、毒邪内蕴证卵巢癌，在近代名医张锡纯治疗妇科肿瘤名方“理冲汤”基础上，总结临床经验制订而成，由黄芪、党参、白术、莪术、白花蛇舌草、肉桂等组成，前期研究结果显示，该方可有效抑制小鼠卵巢癌移植瘤，改善卵巢癌免疫抑制微环境[3];随机对照临床研究发现，益气活血解毒方组中位无进展生存期为21个月，中位无复发生存时间为18.5个月，益气活血解毒方维持治疗是影响无复发生存期的独立预后因素[4,5]。因此有必要利用最新的二代测序技术对益气活血解毒方进行进一步的挖掘和开发，探究其作用机制。

1、对象与方法

1.1对象

选取2022年9月至2023年3月就诊于中国中医科学院广安门医院肿瘤科门诊的PROC患者12例，根据治疗方式不同，将患者分为中医组和对照组，各6例。本研究已通过中国中医科学院广安门医院伦理委员会伦理审查批准(2023-038-KY)。

1.2诊断标准

1.2.1西医诊断标准[6]

依据患者的病史、症状及体征，影像学证据(X线检查，超声，盆、腹腔CT,磁共振成像等),穿刺活检病理学结果(腹水细胞学，肿瘤组织学检查等),肿瘤标志物检查，明确诊断为晚期卵巢癌。临床分期标准：采用国际妇产科联盟分期标准，结合分期手术、腹腔冲洗液或腹水细胞学检查、穿刺活检病理学结果确定临床分期。

1.2.2中医诊断标准[7]

主要辨证为气虚证和血瘀证，在中医主任医师指导下完成。气虚证：必备舌淡、舌淡胖、舌淡边有齿痕其中1项及气短、乏力、自汗、脉弱或脉细弱其中2项；血瘀证：面有瘀斑，疼痛，心前区痛，肢体麻木，半身不遂，肌肤甲错，肤色晦暗，月经有血块，舌暗、有瘀斑、舌下静脉青紫，具备2条及以上即可辨证。

1.3纳入及排除标准

纳入标准：①经病理学检查诊断为原发性上皮性高级别浆液性卵巢癌患者；②在最近1次接受以铂类药物为基础的化疗停药后6个月内复发，或化疗过程中进展，临床判定为铂类耐药或铂难治；③中医证型为气虚血瘀证；④接受过益气活血解毒方治疗3个月以上或未接受过益气活血解毒方治疗；⑤美国东部肿瘤协作组评分0～2分；⑥预计生存期≥3个月；⑦签署了知情同意书。排除标准：①接受益气活血解毒方治疗持续时间在3个月以内；②既往有其他肿瘤病史；③患有严重心脏、肝、肾和造血系统疾病，且未控制者；④无法配合随访者，如伴有严重神经功能缺损(如失语、失认)、精神疾患或其他原因。

1.4治疗方式

对照组接受医师选择的方案(包括多柔比星联合或不联合贝伐珠单抗、紫杉醇周疗联合或不联合贝伐珠单抗、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂等),中医组在接受医师选择的方案的基础上接受益气活血解毒方治疗，组成为：黄芪、党参、白术、莪术、肉桂、白花蛇舌草等。饮片由中国中医科学院广安门医院中药房提供。每日1剂，水煎取汁300 ml,早晚各1次口服。

1.5标本采集方式

由中国中医科学院广安门医院护士使用含有乙二胺四乙酸抗凝的真空采血管采集患者外周血2 ml,在管身标注患者分组和编号。

1.6测序平台

测序采用Illumina测序平台的单端50 bp测序模式对样本进行高通量测序。原始数据需经过引物与adaptor序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段。

1.7抽提与质检

外周血加入6 ml的红细胞裂解液450×g,4℃离心10 min以沉淀白细胞，吸弃上清液；加入1 ml无酶Hank′s溶液进行重悬，450×g,5 min离心，清洗2遍；加入1 ml trizol,反复吹打；加入0.2 ml的氯仿。振荡器剧烈振荡管体15 s后，室温孵育15 min。12 000×g,4℃离心15 min。加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,充分混匀后，常温孵育10 min, 12 000×g,4℃离心15 min。移去上清液，加入1 ml的75%乙醇清洗RNA沉淀。混匀后12 000×g,4℃离心5 min。质检：紫外/可见光分光光度计测RNA纯度，比值范围1.8～2.1。利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性(28S:18S≥1.5),Qubit精确定量RNA浓度(≥500 mg/L)。

1.8文库构建

加A尾，连接接头，利用小RNA的3′及5′端特殊结构(5′端有完整的磷酸基团，3′端有羟基),以总RNA为起始样品，直接将小RNA两端加上接头。反转录合成cDNA。cDNA纯化，QIAseq miRNA NGS Beads分离目标DNA片段，即为cDNA文库。

1.9上机测序

桥式扩增。在cBot仪器上进行桥式聚合酶链反应扩增，生成clusters。Illumina测序平台，采用2×150测序模式进行边合成边测序。测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads),文件为fastq格式。

1.10差异基因筛选

利用DESeq2软件对不同样本组之间筛选差异表达的已知转录本。

1.11差异lncRNA顺式调控靶标基因预测

从生物信息学的角度来预测lncRNA调控的顺式靶标基因。lncRNA在基因组上邻近靶标编码蛋白质基因直接起调控作用，称为顺式调控。根据lncRNA与已知编码蛋白质基因的距离域值设定为lncRNA的上下游100 kb内。

1.12功能分析

经通过基因本体论(GO)描述基因功能的综合性数据库，通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)整合基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库分析。

1.13统计学方法

针对mRNA和lncRNA转录本，转录本表达量计算采用FPKM计算度量指标。利用DESeq2软件对不同样本组之间筛选差异表达的已知转录本。|log2差异位数|≥1和P≤0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2组差异lncRNA筛选

在中医组和对照组中共筛选出595个差异lncRNA,其中353个上调，242个下调。见图1。

图1铂类耐药卵巢癌患者中医组与对照组差异lncRNA筛选A为差异lncRNA火山图；B为差异lncRNA散点图 

2.2差异lncRNA靶基因筛选

根据P<0.005且lncRNA具有已知靶基因进一步筛选，符合条件的共有38个差异lncRNA,其中21个lncRNA能根据作用顺式调控模式预测到靶基因，包括018653.3、LOXL1-AS1、AC005154.1、AC137932.1、LINC00461、AC009950.1、AC034102.6、LINC01094、AC138035.1、CCDC18-AS1、NADK2-AS1、ZNF213-AS1、CCDC18-AS1、HCG27、AC009950.1、MMP25-AS1、AC003991.1、AL157786.1、LINC01089、AC009950.1和DTX2P1-UPK3BP1-PMS2P11(均P<0.001)。

2.3差异表达基因(DEG)筛选

共筛选出514个DEG,其中222个基因上调，292个基因下调。与预测的42个靶基因取交集后得到溶质运载家族3成员2(SLC3A2)、BCL2样蛋白11(BCL2L11)2个重要靶基因，它们可能是益气活血解毒方调控lncRNA作用的靶基因，由lncRNA SNHG1、MIR4435-2HG、AC108463.3调控。

2.4 GO和KEGG分析

GO分析发现，益气活血解毒方调控的DEG在细胞代谢、细胞自噬、蛋白-DNA结合功能中富集。KEGG分析表明益气活血解毒方调控的DEG在血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、凋亡、自噬、癌症中胆碱代谢、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路中富集。

2.5蛋白质相互作用网络构建及关键蛋白筛选

选取DEG中度值排序前50的基因导入STRING网站来绘制蛋白质相互作用网络图，形成具有50个点，1 084条边的网络图。使用Cytohubba插件根据度值筛选排序前10的基因，包括分子量220 000的蛋白激酶D相互作用蛋白(49.0分)、人含PR域蛋白10(49.0分)、泛素A52残留核糖体蛋白融合产物1(49.0分)、蛋白磷酸酶1调节亚基12A(49.0分)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(49.0分)、非受体酪氨酸激酶(48.5分)、泛素B(48.5分)、Ran结合蛋白2(48.5分)、人类拓扑异构酶Ⅱβ(48.0分)、丝裂原活化蛋白激酶3(48.0分)。益气活血解毒方以调控具有凋亡、细胞代谢、DNA修复功能的蛋白为主，以及经典的致癌蛋白肉瘤基因、丝裂原活化蛋白激酶3等。

3、讨论

本研究探究了益气活血解毒方干预PROC患者，能够通过介导lncRNA表达调控其靶基因，尤其是lncRNA SNHG1、MIR4435-2HG、AC108463.3调控的SLC3A2、BCL2L11这两个重要靶基因，从而引起癌细胞的自噬、凋亡、DNA修复等功能的改变，以及抑制VEGF信号通路、肿瘤坏死因子α信号通路、mTOR信号通路的激活。

中医认为卵巢癌属于“癥瘕”“肠蕈”范畴，病理因素以寒、虚、瘀、毒为主，大多患者呈现气虚血瘀证候。益气活血解毒方重用黄芪，以之为君，本病之根为气虚血瘀、癌毒内蕴。黄芪，甘、温，归脾、肺经，大剂量使用扶正消积治其本；党参，味甘，性平，归脾、肺经，白术，性温，味苦、甘，归脾、胃经，与君药黄芪合用增加扶正益气之效；莪术，辛、苦，归肝、脾经，乃消坚利器，治疗女子瘀血积块之要药；白花蛇舌草治疗瘀久化热，具有清化伏毒之功；肉桂药性辛、甘，大热，归肾、脾、心、肝经，起引药下行，引火归元之功，行温通之效。

在本研究中找到了2个可能受益气活血解毒方调控的主要lncRNA,其中lncRNA SNHG1与小核仁RNA密切相关。小核仁RNA是一类主要存在于核仁中的非编码RNA,超过一半的小核仁RNA是从宿主基因转录而来，其中小核仁RNA宿主基因(SNHG)占了将近4/5。SNHG作为一种lncRNA可通过多种分子调节机制参与肿瘤发生[8]:在细胞核中，SNHG通过甲基化酶影响DNA甲基化或与转录因子相互作用调控基因转录；在细胞质中，可以通过充当微小RNA海绵来影响mRNA的稳定性或其翻译[9]。SNHG1的过表达通过调节SLC3A2激活蛋白激酶B信号传导，从而导致耐药性[10]。lncRNA MIR4435-2HG位于人类染色体2q13上，被发现在卵巢癌中升高，与国际妇产科联合会分期、肿瘤分级和淋巴结转移密切相关[11]。MIR4435-2HG在卵巢癌患者早期过表达，与健康对照组不同，MIR4435-2HG还加速了卵巢癌细胞的侵袭和迁移[12]。Zhu等[13]发现，在卵巢癌患者中，MIR4435-2HG的显著高表达与较差的生存期相关，敲低MIR4435-2HG抑制卵巢癌细胞增殖和迁移，促进卵巢癌细胞凋亡。AC108463.3目前暂无相关研究，本研究结果给予了一个可能的研究方向。

靶基因SLC3A2通过募集SLC7A5、SLC7A11/xCT到质膜调节氨基酸转运，在肿瘤生长和控制氧化应激中发挥重要作用[14],也被研究证明其与铁死亡和双硫死亡有关[15]。而SLC7A11和SLC3A2的表达下调，会影响Xc系统(一种专用的胱氨酸转运器),导致肿瘤细胞通过Janus激酶信号发生铁中毒，使其成为抗癌疗法的一个聚焦靶点，SLC3A2编码的细胞表面跨膜蛋白CD98hc已被证明是头颈部鳞状细胞癌、肺癌和前列腺癌中的铁死亡介质[16]。CD98hc通过转运氨基酸、增强整合素信号转导以及激活mTOR、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路[17,18,19]来促进癌细胞增殖和肿瘤生长。BCL2L11启动子包含一个广泛的富含CpG的区域，该区域的高甲基化与低促凋亡蛋白淋巴细胞瘤2相互作用的细胞凋亡调节因子(BIM)表达有关。BIM被发现是HT-29结肠癌细胞中线粒体凋亡信号转导完全参与所必需的[20]。这些靶基因的功能都与细胞的程序性死亡相关，包括凋亡、自噬、铁死亡、双硫死亡，因此推测益气活血解毒方治疗PROC的作用机制可能与调节癌细胞的程序性死亡相关。

基于优势人群概念，筛选宏观临床表型或微观生物标志物，由此研发的克唑替尼、曲妥珠单抗等分子靶向药物在肿瘤治疗中发挥了重要的研究示范作用[21]。本研究中发现的lncRNA SNHG1和lncRNA MIR4435-2HG以及靶基因SLC3A2可能受益气活血解毒方下调，因此这些微观指标有潜力与症状、体征、舌脉、证候要素和体质等宏观资料相结合对中医优势人群进行筛选，实现中医药的精准治疗从而减轻患者负担，提高中医治疗的有效性。本研究每组仅纳入6例患者，患者间个体化差异较大，不能排除其他内科基础疾病对转录组测序结果的影响。在未来，我们将对本研究发现的lncRNA和预测靶基因在患者外周血中表达情况进行检测以对益气活血解毒方治疗PROC的机制进行进一步探讨。

综上所述，益气活血解毒方治疗PROC患者的靶点是由lncRNA SNHG1、MIR4435-2HG、AC108463.3调控的SLC3A2、BCL2L11基因，从而调控了癌细胞的程序性死亡等生物学行为和癌症的经典通路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[3]李娟.基于网络药理学联合mRNA芯片探讨益气活血解毒方治疗卵巢癌的效应机制[D].北京:中国中医科学院,2020.

[4]吴晓晴,常磊,卢雯平.益气活血解毒方调控IL-6对铂耐药卵巢癌患者巨噬细胞表型的影响[J].北京中医药大学学报,2022,45(2):208-216.

[6]中国临床肿瘤学会指南工作委员会.卵巢癌诊疗指南2023[M].北京:人民卫生出版社,2023:10-13.

[7]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(试行)[M].北京:中国医药科技出版社,2002:286-290.

[21]许博文,张潇潇,李杰,等.基于优势人群的肿瘤中医药防治疗效提升策略[J].中医杂志,2022,63(4):318-322.

基金资助:国家中医药管理局中医药创新团队及人才支持计划项目(ZYYCXTD-C-202205)~~;

文章来源:吴晓晴,卢雯平.益气活血解毒方治疗铂类耐药卵巢癌患者的作用机制探究[J].中国医药,2024,19(05):654-658.