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肾癌应用索拉菲尼治疗的影响因素及耐药机制研究

2020-07-11 439 上传者：管理员

摘要：目的索拉菲尼是肾癌一线治疗药物,而临床观察发现患者对索拉菲尼药物治疗的应答效果不同。本研究旨在探讨影响肾癌索拉菲尼治疗效果的危险因素,并进一步对PTPN11表达进行对比研究。方法选取北部战区总医院2006-01-01-2016-12-30经口服索拉菲尼治疗〔400mg(200mg×2),口服,2次/d〕的肾癌患者共126例,随访患者临床数据,检测影响索拉菲尼治疗效果的危险因素。进一步选取基线数据差异无统计学意义的长/短无进展生存期(PFS)的患者各6例,分为非耐药组及耐药组,采用免疫组化分析PTPN11蛋白在肾癌及癌旁的组织分布差异,采用RT-PCR方法检测2组患者PTPN11基因的表达差异。结果单因素分析提示,地区、体质量指数(BMI)、美国东部肿瘤协作组(ECOG)一般状况评分、肿瘤转移情况、是否手术治疗、纪念凯特琳癌症中心(MSKCC)评分与患者PFS相关,P<0.05。进一步多因素分析提示,地区(HR=1.627,95%CI为1.039～2.548)、是否手术治疗(HR=0.520,95%CI为0.353～0.767)、MSKCC评分(HR=3.397,95%CI为2.599～4.441)与患者PFS相关,P<0.05;可作为影响索拉菲尼治疗肾癌疗效的独立危险因素。免疫组化提示,肾癌组织中PTPN11高表达,而癌旁组织中表达较低。Real-timePCR结果提示,PTPN11分子耐药组(7.13±0.42)较非耐药组(6.22±0.38)高表达,差异有统计学意义,t=3.827,P=0.03。结论肾癌患者所处地区、是否手术治疗及MSKCC评分等可能是影响患者使用索拉菲尼治疗效果的独立危险因素,且PTPN11基因表达可能与肾癌索拉菲尼耐药相关。

关键词：
PTPN11
独立危险因素
索拉菲尼
耐药机制
肾癌
肿瘤用药
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肾癌是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，肾癌发病率约占全部恶性肿瘤2.2%左右[1]。在中国，近20年肾癌发病率平均每年增加约6.5%，其癌症相关死亡率超过膀胱癌，在泌尿生殖系统癌症中排名第1位[2]。肾癌对于放化疗均不敏感。目前临床发现，肾癌患者使用索拉菲尼药物治疗敏感性差异很大，比起部分患者2～3年的药物受益时间，有相当一部分患者仅数月就发生了疾病进展。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体11型（PTPN11）分子参与肝癌、乳腺癌等多个肿瘤的发生发展，在肿瘤耐药产生、肿瘤干细胞调控等多个生物学过程中发挥重要作用，而在肾癌领域研究较少[3,4]。因此，本研究探讨影响索拉菲尼治疗肾癌效果的危险因素，分析PTPN11分子与肾癌耐药的相关性，有望更好地指导临床用药，为肾癌耐药机制研究提供参考。

1、材料与方法

1.1标本来源

选取北部战区总医院2006-01-01-2016-12-30经口服索拉菲尼治疗的肾细胞癌患者共126例，男65例，女61例。年龄19～80岁，中位年龄55岁。甲基磺酸索拉菲尼（德国拜尔公司）采取连续用药方案，用法为400mg(200mg×2），口服，2次/d，服药前禁食2h。

在临床危险因素分析的基础上，进一步选取基线数据差异无统计学意义的长/短无进展生存期（PFS）患者各6例，分为非耐药组及耐药组，采用免疫组化分析PTPN11蛋白在肾癌及癌旁的组织分布情况，采用RT-PCR方法检测2组患者PTPN11分子mRNA的表达是否存在差异。

1.2主要试剂与仪器

PTPN11兔抗人一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司，DAB显色试剂盒购自北京Solarbio公司，RNAprepPure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、FastKingcDNA第一链合成试剂盒、Super Real Pre MixPlus(SYBRGreen）购自根生化科技（北京）有限公司。7300/7900荧光实时定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，3K15型高速离心机购自美国SIGMA公司，EG1150H免疫组化石蜡包埋机、Bond免疫组化制片仪、RM2145型免疫组化冰冻切片仪购自德国Leica公司。

1.3PTPN11基因表达Real-timePCR检测

使用RNAprepPure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒提取组织总RNA，使用FastKingcDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，使用SuperReal荧光定量预混试剂进行PCR反应体系扩增。

1.3.1RNA提取及cDNA合成

按照试剂盒说明书提取6例患者肝癌组织及癌旁组织（距离肿瘤组织<3cm）的总RNA，分光光度计测其浓度，而后按照试剂盒说明书进行合成cDNA。

1.3.2引物设计

登陆NCBI查找基因序列，采用引物设计软件PrimerPremier6进行引物设计，选取评价“best”的引物序列，送至大连赛拓生物科技有限公司合成。

1.3.3PCR扩增

按试剂盒说明书配置25μLPCR反应扩展体系，PCR扩展采用两步法，预变性1×95℃15min,PCR反应40×95℃10s变性、60℃20s退火/延伸，于60℃设置荧光检测点进行扩增。

1.4PTPN11蛋白表达免疫组化检测

1.4.1抗原修复

石蜡切片经二甲苯透明后乙醇浸泡，漂洗3min。切片插入塑料架上，浸入枸橼酸缓冲液（pH6.0）内，放入压力锅修复时间约为2min．将切片放入质量分数0.3%甲醇-H2O230min，灭活内源性过氧化物酶。

1.4.2背景封闭

取出切片后，吸水纸擦干周围液体，滴加质量分数为10%的BSA封闭液，37℃下孵育30min，吸水纸吸干周围液体。

1.4.3检测目标

滴加PTPN11一抗（1∶100稀释），4℃过夜；滴加生物素标记二抗（1∶500稀释）室温孵育2h；滴加SP，室温孵育30min。

1.4.4样品可视化

滴加适量现配DAB显色液，显微镜下控制显色程度；脱水；透明；封化：苏木精染色40s，水洗1min；乙醇及二甲苯梯度浸泡后中性树胶封片。最后，显微镜观察并摄像。

1.5统计学方法

采用SPSS19.0对数据进行统计学分析，计量资料以表示，采用K-S法进行正态分布检验，符合正态分布采用t检验比较组间差异，不符合正态分布采用Wilcoxon秩和检验比较组间差异。分类变量的比较采用χ2检验。单/多因素相关性分析采用Cox回归法。检验水准α=0.05（双测）。

2、结果

2.1影响索拉菲尼治疗肾癌疗效的临床危险因素

随访126例患者临床数据，根据患者PFS中位值分为长、短2组（表1）。BMI处于18.5～24.9认为正常。对长短2组PFS患者进行单因素分析，显示地区、体质量指数（BMI）、美国东部肿瘤协作组（ECOG）一般状况评分、肿瘤转移情况、是否手术治疗、纪念凯特琳癌症中心（MSKCC）评分与患者PFS长短相关。进一步多因素分析提示，地区、是否手术治疗、MSKCC评分与患者PFS相关，见表2。

2.2PTPN11基因表达

所有患者的PTPN11mRNA在癌组织中表达均显著高于癌旁组织，P<0.05；其中PTPN11在耐药组癌组织中表达高于非耐药组，P<0.05；在癌旁组织中差异无统计学意义，P>0.05，见表3。

表1126例肾细胞癌患者按中位PFS分为长短2组的临床信息

表2126例肾细胞癌患者临床信息与PFS的单和多项因素回归分析

2.3免疫组化检测PTPN11的表达

免疫组化结果显示，6例患者中PTPN11在肾癌组织是高表达，而在癌旁组织中的表达量较低，见图1。

3、讨论

在世界范围内，各国或地区的肾癌发病率各不相同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市地区高于农村地区，男性多于女性，男女患者比例约为2∶1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄在50～70岁[5,6]。肾癌的病因未明，已经明确与肾癌发病相关因素有遗传、吸烟、肥胖及抗高血压治疗等[7,8]。

表3PTPN11分子mRNA在12例肾细胞癌及癌旁组织中的表达水平

图1肾癌组织和癌旁组织中PTPN11的表达（ABC×100)

对于尚未转移的肾癌，以手术治疗为主；即便是已发生远处转移的患者，在全身治疗前也需对患者行肿瘤细胞减灭肾切除术[9]。转移性肾癌主要以全身性治疗为主，由于肾癌对方化疗不敏感，目前以生物治疗（免疫治疗）及靶向药物治疗[10,11,12,13]。2005-12美国FDA最早批准索拉菲尼用于转移性肾癌患者的治疗，直至今日索拉菲尼仍是肾癌治疗的一线选择药物[14]。而临床观察发现，患者对索拉菲尼药物治疗的应答效果不同。本研究通过收集大量临床病例回顾分析发现，肿瘤患者所处地区、是否手术治疗及MSKCC评分可作为评价索拉菲尼治疗肾癌效果的独立危险因素，这也与肾癌好发于城市，且优先选择手术切除治疗等特点相一致。

PTPN11基因是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，人PTPN11基因定位于12q24.1，含1～16号外显子[15]。PTPN11基因编码的SHP-2蛋白在哺乳动物细胞质中广泛表达，由N末端含2个Src同源结构域（N-SH2、C-SH2），中间为磷酸酶活性功能域，C末端由多个酪氨酸磷酸化位点及富含脯氨酸的基序构成[16,17,18]。PTP是信号分子，调节多种细胞过程，包括细胞生长、分化、细胞周期以及恶性转化。这包含2个串联的Src同源结构域，作为磷酸酪氨酸结合结构域介导该PTP与底物的相互作用[19]。这种PTP在大多数组织中广泛表达，在不同的细胞信号传导和多种细胞生物学功能中起调节作用，如丝裂原活化、代谢调控、转录调控和细胞迁移[20,21]。在机体的信号转导通路中，蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶通过其对蛋白质的磷酸化和去磷酸化对多种信号通路发挥作用，其中就包括对肿瘤的发生发展的调节作用[22]。目前PTPN11在肾癌领域的研究较少。本研究在临床数据分析的基础进一步选取基线数据差异无统计学意义的长、短PFS患者各6例，分为非耐药组及耐药组。免疫组化结果显示，PTPN11蛋白在癌组织较癌旁组织高表达。同时，Real-timePCR方法检测2组患者PT-PN11基因表达发现耐药组较非耐药组高表达，提示PTPN11基因表达可能与索拉菲尼治疗肾癌药物抵抗相关。

本研究通过对肾癌索拉菲尼治疗效果的临床危险因素分析及耐药机制研究，有望为索拉菲尼治疗肾癌临床更为合理有效的用药提供指导，为更进一步的肾癌耐药机制研究提供参考。

参考文献：

[7]张金超,王丹红.转移性肾癌的临床治疗进展[J].临床泌尿外科杂志,2016,31(6):574-579.

[8]管金,哈木拉提·吐送,王玉杰,等.肾癌患者血清微小RNA-21手术前后表达变化及临床意义分析[J].中华肿瘤防治杂志,2016,23(7):441-445.

[10]孔丹丹,江龙委,郑劼,等.DC-CIK细胞治疗晚期肾癌临床疗效及预后分析[J].中华肿瘤防治杂志,2018,25(21):1515-1521.

[11]张弘,周明澍,蒋鸿涛,等.分子靶向药物在肾癌中的研究进展[J].西南军医,2018,20(5):537-541.

[12]潘泉,周建立,丁承宗.肾癌常见病理亚型的CT表现及强化特点分析[J].中华肿瘤防治杂志,2016,23(7):457-461.

[14]李永强,李汉忠,邓建华,等.索拉菲尼治疗进展性肾癌长期存活因素的探讨[J].临床泌尿外科杂志,2015,30(7):607-609.

韩涛,刘兆喆,谢晓冬.索拉菲尼治疗肾癌疗效影响因素及耐药机制研究[J].中华肿瘤防治杂志,2020,27(11):910-914.

基金:国家自然科学基金(81702622)