胃癌是一种常见的恶性肿瘤,是世界癌症死亡的第三大原因[1]。虽然近年来在胃癌的发病机制和临床研究方面取得了较多突破,但目前胃癌的总体预后仍然欠佳[2]。近期许多研究表明,胃癌的发生发展与细胞增殖、分化和转移的异常基因表达有关[3,4]。

长链非编码(lncRNA,long-chainnon-codingRNA)是一种不编码蛋白质的RNA,它由RNA聚合酶II转录,一般长于200个核苷酸[5]。lncRNA参与细胞生物学中的许多重要过程,如:信号传导的调控、DNA修饰、转录激活、转录后调控和蛋白质功能调节等[6]。许多研究认为lncRNA在肿瘤细胞的发展、耐药和转移中发挥了重要作用[7,8]。其中,SNHG1(smallnucleolarRNAhostgene1)是一种新发现的lncRNA,它位于染色体的11p12.3区域,长约3927个碱基[9]。SNHG1已经被证实在许多类型的肿瘤组织中高表达,如肺癌、肝癌、食管癌、胆管癌等[10],它能够通过与p53竞争性结合hnRNPC,重组人不均一核核糖核蛋白C)来调节p53表达水平和活性,从而促进肿瘤发生发展[11]。另外,SNHG1还可以作为ceRNA(内源竞争RNA)与各种miRNA竞争性结合,抑制miRNA对靶基因的调控从而发挥作用[10]。然而,lncRNASNHG1的表达及其在胃癌中的生物学功能目前尚未明确。

本研究探讨了lncRNASNHG1在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响,为胃癌的治疗寻找潜在的治疗靶点和预后标志物。

1、材料与方法

1.1材料

人永生化胃上皮细胞(GES-1)及胃癌细胞(NCI-N87和MKN-45)购自(ATCC,美国)。实验中PCR引物,SNHG1探针、SNHG1过表达质粒及其shRNA干扰质粒,p27kip1过表达质粒及其shRNA干扰质粒均由上海吉玛公司合成。

1.2样本收集

在2017年6月至2018年6月期间,针对本院就诊患者中确诊胃癌、未接受术前放化疗或其他抗癌治疗的患者,在其知情同意的情况下,收取手术标本(胃癌组织和配对的癌旁组织),标本量为26例。标本保存于液氮中备用。

1.3原位杂交和免疫组化

为了检测胃组织中lncRNASNHG1的表达水平,根据试剂盒说明书进行原位杂交实验(试剂盒购于Boster公司,武汉)。将地高辛标记的lncRNASNHG1探针(1∶400)加入组织石蜡切片中,55℃孵育1小时后洗涤;随后试剂密封组织1小时,去除试剂后将组织切片置于含有抗地高辛抗体(1∶200)的TBST中,37℃孵育1小时;最后用HE染色,在显微镜下观察拍照。免疫组化检测均在本院病理科进行,p27kip1抗体(1∶200)购自SantaCruz公司(美国)。

1.4实时定量逆转录PCR

按说明书使用Trizol试剂(Vazyme,上海)从组织及细胞中提取总RNA。使用逆转录试剂盒(Takara,日本)将RNA逆转录成cDNA,后用SYBRPremixEXTaq试剂盒(Takara)完成实时荧光定量PCR实验。引物序列见表1。

表1引物序列

1.5细胞培养及转染

将细胞在含有10%胎牛血清(Gibco,美国)的DMEM中于5%CO2、37℃条件下培养。转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen(美国)。将pcDNA3.1-SNHG1、shSNHG1、pcDNA3.1-p27kip1及shp27kip1质粒根据说明书分别转染相应细胞(其中lipo∶质粒=2∶1),转染48小时后根据各质粒携带的抗性基因,分别给予嘌呤霉素(终浓度1μg/ml)或新霉素(终浓度400μg/ml)筛选,构建稳定细胞株。其中,shSNHG1序列:5'-GGCCAGCACCTTCTCTCTAAACTCGAGTTTAGAGAGAAGGTGCTGGCCTTTTT-3',shp27kip1序列:5'-CCGGGTAGGATAAGTGAAATGGATACTCGAGTATCCATTTCACTTATCCTACTTTTTG-3'[12]。获得的稳定细胞株继续在上述培养条件下培养。

1.6细胞活力测定

本研究使用CCK-8试剂盒(Beyotime,上海)进行细胞活力测定。以1500个/每孔的密度将细胞接种于96孔板中,待细胞完全贴壁后,分别在0、24、48、72和96小时向每个孔中加入CCK-8试剂,37℃下孵育4小时后用酶标仪测量其在490nm处的OD值,记录该OD值,并计算细胞活力。实验设六个复孔,独立重复三次。

1.7克隆形成实验

将细胞以1000个/每孔的密度接种在6孔板中,于正常培养条件下培养两周。用PBS小心洗涤细胞两次,加入预冷甲醇固定30分钟,移除甲醇后用1%结晶紫染料染色20分钟,清水漂洗,晾干后拍照计数细胞集落数。

1.8细胞周期测定

细胞周期检测试剂盒购自KeyGEN公司(南京)。取对数生长期细胞,胰酶消化后1000r/min离心3分钟收集细胞,PBS小心漂洗两遍,得到的细胞沉淀用300μlPBS重悬。向悬液中逐滴加入预冷无水乙醇700μl,4℃过夜固定。次日离心收集细胞,并用预冷PBS清洗残余乙醇。避光条件下加入20μlRNase(工作浓度50μg/ml)和20μlPI(工作浓度50μg/ml),避光室温染色30分钟,随后上机检测(FACSAriaII,BD,美国)并计算。

1.9Westernblot

用RIPA裂解细胞并提取细胞总蛋白,按BCA试剂盒(KeyGEN)说明书进行蛋白定量。将等量的细胞蛋白在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳,后用湿转法转至PVDF膜上(Millipore,USA),脱脂奶粉封闭2小时后,一抗4℃孵育过夜。次日TBST洗涤后,加入相应的二抗,于室温下孵育1小时,GAPDH、p27kip1抗体(1∶500)及二抗均购自SantaCruz。最后将膜在TBST中漂洗彻底,加入ECL显影液(Beyotime),在BioRAD凝胶成像仪上曝光显影。

1.10统计学分析

本研究使用GraphPadPrism7软件进行统计学分析。计量数据表示为平均值±标准偏差(x¯±s)(x¯±s)。通过配对t检验或独立样本t检验进行组间平均差异的比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1lncRNASNHG1在胃癌组织及细胞中高表达

为了确定lncRNASNHG1在胃癌中的表达情况,运用RT-qPCR法检测26组配对胃癌组织和癌旁组织中的SNHG1水平。RT-qPCR结果显示:SNHG1在胃癌组织中的表达明显上调(图1A)。原位杂交后HE染色结果也显示,相比于癌旁组织,胃癌组织中SNHG1表达增高(图1B)。此外,我们根据患者临床资料,按不同疾病分期组织整理数据,发现SNHG1表达与胃癌TNM分期有关,其中中晚期胃癌SNHG1的表达明显高于早期(图1C)。为了进一步验证上述结果,我们检测了SNHG1在胃癌细胞(MKN-45、NCI-N87)和永生化胃上皮细胞(GES-1)中的表达,发现SNHG1在胃癌细胞中的表达显著高于永生化胃上皮细胞(图1D)。这些数据均表明lncRNASNHG1在胃癌中高表达。

图1lncRNASNHG1在胃癌组织及细胞中高表达

2.2下调lncRNASNHG1抑制胃癌细胞增殖

为了进一步探讨lncRNASNHG1在胃癌中的作用,我们构建shSNHG1质粒,并将其转染入NCI-N87细胞中以下调细胞中的SNHG1水平,并通过RT-qPCR验证转染效果(图2A)。CCK-8实验结果显示下调NCI-N87细胞中的SNHG1后,其细胞增殖能力明显受到抑制(图2B)。同时,克隆形成实验也显示下调SNHG1后,NCI-N87形成细胞集落的能力明显减弱(图2C-2D)。此外,细胞周期测定结果发现,下调SNHG1可以诱导细胞周期停滞在G0/G1期(图2E-2F)。以上数据表明,下调lncRNASNHG1可以抑制人胃癌细胞的增殖。

2.3上调lncRNASNHG1促进胃癌细胞增殖

我们向胃癌细胞MKN-45中转染pcDNA3.1-SNHG1质粒以上调SNHG1,并通过RT-qPCR验证了转染效果(图3A)。CCK-8实验结果显示,过表达SNHG1后,胃癌细胞MKN-45的增殖能力显著增强,72小时效果最为明显(图3B)。克隆形成实验表明上调SNHG1可以促进胃癌细胞的集落形成能力(图3C-3D)。而细胞周期测定进一步证明了上调SNHG1可显著减少MKN-45细胞G0/G1期的细胞周期停滞现象(图3E-3F)。上述实验结果证明lncRNASNHG1的上调可促进人胃癌细胞的增殖。

图2下调lncRNASNHG1抑制胃癌细胞增殖

图3上调lncRNASNHG1促进胃癌细胞增殖

2.4lncRNASNHG1通过抑制p27kip1促进肿瘤生长

为了揭示SNHG1调控胃癌细胞增殖的机制,我们针对其可影响细胞周期这一细胞生物学现象,检索了相关文献资料,并通过RT-qPCR检测了临床样本中细胞周期相关蛋白mRNA的表达情况。其中,p27kip1表达在胃癌组织及相应癌旁组织中有显著差异(图4A)。我们通过免疫组化进一步证实了这一发现:相比于癌旁组织,p27kip1在胃癌组织中的表达明显偏低(图4B-4C)。通过统计学计算分析发现p27kip1与lncRNASNHG1的表达负相关,Pearson相关系数为-0.5208(图4D)。我们随后检测了p27kip1在胃癌细胞及永生化胃上皮细胞中的表达情况,RT-qPCR结果显示:永生化胃上皮细胞GES-1中的p27kip1表达明显高于胃癌细胞MKN-45和NCI-N87(图4E)。为了验证我们的假设,我们将shSNHG1转染到NCI-N87细胞中(图4F),RT-qPCR和Westernblot结果显示下调SNHG1后,NCI-N87细胞中p27kip1的表达在mRNA和蛋白质水平明显提高(图4G-4H)。随后,我们将pcDNA3.1-SNHG1转染到MKN-45细胞中上调lncRNASNHG1(图4F),与预期的结果一致,随着SNHG1的上调,MKN-45细胞中的p27kip1mRNA和蛋白质水平被抑制(图4G-4H)。

图4p27kip1在胃癌组织及细胞中的表达与lncRNASNHG1负相关

另一方面,我们通过分别向NCI-N87和MKN-45细胞中转染pcDNA3.1-p27kip1或shp27kip1,以上调或下调胃癌细胞中p27kip1的表达(图5A-5B),RT-qPCR结果显示胃癌细胞中p27kip1表达水平的变化对SNHG1的表达并无明显调节作用(图5C)。因此我们推断,lncRNASNHG1可能通过影响p27kip1在胃癌中发挥作用。

图5lncRNASNHG1的表达不受p27kip1调节

最后,本研究进行了拯救试验来证实SNHG1是否通过p27kip1依赖性方式诱导胃癌发生发展。我们向SNHG1过表达的稳定细胞株MKN-45SNHG1中转染pcDNA3.1-p27kip1,以上调细胞中p27kip1的表达水平,并通过RT-qPCR和Westernblot验证细胞株中p27kip1水平的变化(图6A-6B)。CCK-8结果显示,MKN-45SNHG1细胞过表达p27kip1后,其由SNHG1上调引起的较高水平的细胞增殖速度被明显抑制(图6C)。此外,细胞周期测定也同样显示,过表达p27kip1可以抑制MKN-45SNHG1细胞中由SNHG1上调引起的G0/G1期变化(图6D-6E)。这些数据均证明lncRNASNHG1通过抑制p27kip1促进胃癌细胞的增殖。

图6lncRNASNHG1抑制p27kip1以促进肿瘤生长

3、讨论

胃癌是全球发病率较高的恶性肿瘤之一,中国每年新诊断的胃癌病例近70万例,占世界新发病例一半左右。且大多数病例发现时即处于晚期阶段,每年中国胃癌相关死亡病例近50万例[13]。尽管越来越多的治疗手段被应用于胃癌,但发现新的生物标志物和靶向治疗以提高胃癌治疗效果、延长有效生存期仍至关重要。近年来,许多研究证实lncRNA参与肿瘤生长信号的调节[14],但lncRNA的大部分生物学功能仍不清楚。lncRNASNHG1也称为linc00057,由UHG转录而来,包含9个外显子,可以通过不同的信号途径促进肿瘤发生。在肝癌中SNHG1可以促进肿瘤细胞生长,且与肝癌的预后不良密切相关[15]。SNHG1可以促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭转移[16]。敲低SNHG1可抑制胆管癌细胞增殖及迁移,并与胆管癌的预后不良有关[12]。此外,有研究表明在人淋巴母细胞受到照射后TK6细胞内SNHG1水平明显升高[17]。Hu等人研究发现lncRNASNHG1与胃癌T分期、TNM分期和淋巴结转移有关,且SNHG1高表达的患者预后显著较差,Hu认为lncRNASNHG1可作为预测胃癌预后的一种新型标志物[18]。本研究数据显示,与癌旁组织相比,SNHG1在胃癌组织和细胞系中的表达显著上调,且与TNM分期相关。此外,我们发现SNHG1水平与胃癌细胞的增殖能力存在相关性,敲低或过表达lncRNASNHG1可调控胃癌细胞的增殖及细胞周期,这与SNHG1在非小细胞肺癌中的作用相似[16]。

为进一步阐明lncRNASNHG1促进胃癌增殖能力的具体机制,我们检索相关文献,发现肺癌中SNHG1可以下调p27kip1蛋白水平从而推进肺癌进程[19]。本研究中我们检测了细胞周期相关蛋白的表达量,通过统计分析发现p27kip1的表达和lncRNASNHG1呈负相关。p27kip1是细胞周期负调控因子,它属于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制蛋白Cip/Kip家族的一员,可以结合并阻止细胞周期蛋白E-CDK2或D-CDK4复合物的活化,从而诱导细胞周期停滞在G1期,抑制细胞进入S期,因此它也被定义为CDK抑制剂[20,21]。此外,p27kip1还与细胞周期相关蛋白以外的蛋白质相互作用,参与各种生物学进程,包括DNA复制、基因转录、细胞凋亡和分化等[22,23,24]。最近研究发现,p27kip1蛋白在多种恶性肿瘤组织中表达降低或缺失,如乳腺癌、急性白血病、非小细胞肺癌等[25]。本研究通过调控lncRNASNHG1的表达,在胃癌细胞系也同样证明lncRNASNHG1负向调控p27kip1的表达。值得注意的是,我们实验结果显示p27kip1的水平变化对lncRNASNHG1的表达并无明显调节作用。本研究中最后的拯救试验进一步证实了SNHG1是通过p27kip1依赖性的方式诱导胃癌细胞增殖的。

综上所述,lncRNASNHG1在胃癌中上调并抑制p27kip1表达,从而促进胃癌细胞增殖。因此,lncRNASNHG1可能作为胃癌预后的新预测因子和胃癌治疗的潜在靶标。

黄鸥翔,施烯,崔静.lncRNASNHG1通过抑制p27kip1促进胃癌细胞的增殖作用[J].现代肿瘤医学,2020,28(14):2378-2384.

基金:福建省自然科学基金资助项目(编号:2018J01159)