支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，全球哮喘网络(Global Asthma Network)Ⅰ期研究显示成人哮喘患病率为4.4%,其中严重哮喘患病率为2.6%[1]。目前西药控制哮喘主要是支气管舒张剂，长期控制效果欠佳，而中医药在慢性疾病的治疗上有其独特的优势。乌梅丸出自《伤寒论·辨厥阴病脉证并治第十二》,原方多用于治疗上热下寒、蛔虫内扰所致的蛔厥。清代伤寒学家柯韵伯在《古今名医方论》提出：“乌梅丸为厥阴主方，非只为蛔厥之剂”。且该方集酸苦甘辛、大寒大热于一体，广泛用于寒热错杂虚实兼并之证。故古今医家常在乌梅丸基础上加减化裁，治疗寒热错杂之各科诸症，并在肺系疾病的防治上取得明显疗效。研究表明乌梅丸具有抗炎、调节免疫、抑制细胞凋亡、修复黏膜屏障和抗氧化损伤等作用[2-3],并且能够治疗哮喘，缓解气道重塑[4]。但中药复方发挥作用的机制和药效物质基础复杂，目前尚未完全明确。

网络药理学对于揭示中药复方科学内涵、发现药物靶标、指导中药新药研发提供了新思路[5]。分子对接对药物虚拟筛选和药物设计具有重要现实意义[6]。故本研究采用网络药理学、分子对接结合实验验证探析乌梅丸治疗哮喘的作用机制。

1、材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 乌梅丸相关靶点筛选

通过TCMSP数据库[7]寻找10味中药化学组成成分，根据口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18筛选出乌梅丸化学成分及成分作用靶点，最后在Uniprot[8]数据库对靶点进行规范化。

1.1.2 支气管哮喘相关靶点筛选

以“Bronchial asthma(支气管哮喘)”和“Asthma(哮喘)”为关键词，在GenCards数据库[9]、TTD数据库[10]、OMIM数据库、DrugBank数据库[11]中查找治疗哮喘的靶点。在GeneCards数据库中，Score值越大则代表该靶点与疾病联系越紧密。将4个疾病数据库中哮喘靶点合并后删去重复值，最后在Uniprot数据库对靶点进行规范化。

1.1.3 PPI网络及乌梅丸成分-支气管哮喘靶点网络图的构建

将乌梅丸靶点和哮喘靶点取交集并绘制韦恩图。将交集靶点提交至String 11.5数据库[12]构建蛋白互作(PPI)网络。将PPI tsv文件导入Cytoscape 3.9.0绘制乌梅丸成分-支气管哮喘靶点网络图。根据连接度(Degree)、介度(Betweenness Centrality)及紧密度(Closeness Centrality)判断核心靶点。

1.1.4 功能与通路的富集分析

将乌梅丸和哮喘的交集靶点导入Metascape平台[13],设置P<0.01,进行功能与通路富集分析。

1.1.5 成分-靶点分子对接

先用ChemOffice软件构建核心活性成分的3D结构保存为mol2格式并使其能量最小化。选择核心活性成分作用于支气管哮喘的靶点进行分子对接，从PDB[14]数据库下载蛋白质3D结构PDB格式，运用PyMol软件对蛋白质进行去水、去除小分子配体等操作，利用Auto Dock Tools软件将核心活性成分及靶蛋白格式转换为pdbqt格式，最后运行Auto Dock Vina进行对接。

1.2 动物实验验证

1.2.1 药物

乌梅丸由当归4 g(批号21100122)、花椒4 g(批号20090210)、人参6 g(批号21050001)、细辛6 g(批号21100129)、制白附子6 g(批号21070204)、盐黄柏6 g(批号20090129)、桂枝6 g(批号21080020)、干姜9 g(批号20110010)、黄连片12 g(批号21090055)、乌梅30 g(批号21100367)组成，上述免煎颗粒购自四川新绿色药业科技发展有限公司。醋酸泼尼松片(规格5 mg/片，批号H33021207)购自浙江仙琚制药股份有限公司。

1.2.2 动物

BALB/c小鼠，SPF级，雌性，体质量(20±2) g, 6～8周龄，购自成都达硕生物科技有限公司[实验动物生产许可证号SCXK(川)2020-030],饲养于成都中医药大学中内脏腑病证实验室小鼠房[实验动物使用许可证号SCXK(川)2017-179],普通饲料饲养，自由摄食饮水。动物实验设计经成都中医药大学动物实验伦理委员会审核通过(伦理号2022-38)。

1.2.3 试剂

鸡卵清蛋白(OVA)(批号A5253-250G,美国Sigma-Aldrich公司);氢氧化铝干粉(批号2204192,西陇科学股份有限公司);小鼠VEGF-A ELISA试剂盒(货号E-EL-M1292c, 美国eBioscience公司);小鼠Akt免疫组化试剂盒(货号YT0185, 美国ImmunoWay公司)。

1.2.4 仪器

D3024R台式高速冷冻离心机(美国SCILOGEX公司);E-clipse Ci-L正置白光拍照显微镜(日本Nikon公司);Pannoramic全景切片扫描仪(匈牙利3DHISTECH公司);NE-C28欧姆龙压缩雾化器[欧姆龙(大连)有限公司];Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)。

1.2.5 分组、造模及给药

参照课题组前期造模方法[15]。适应性饲养1周后，将36只小鼠随机分成正常组、模型组、泼尼松组和乌梅丸低、中、高剂量组，每组6只。除正常组外，其余组小鼠于第1、8、15天腹腔注射致敏液 0.2 mL(含OVA 50 μg和氢氧化铝干粉4 mg),从第22天起，每天给予1%OVA溶液雾化吸入，每天1次，每次30 min, 共7 d。每次雾化激发前1 h, 正常组、模型组给予生理盐水灌胃，乌梅丸低、中、高剂量组分别给予5.8、11.6、23.2 g/kg乌梅丸药液灌胃，泼尼松组给予5.2 mg/kg泼尼松药液灌胃，每天1次，连续7 d。

1.2.6 取材

末次给药24 h后处死小鼠，取小鼠左肺，用于制备肺组织石蜡切片；右肺组织置于-80 ℃冰箱冻存，待测。

1.2.7 肺组织病理学及免疫组织化学检测

取适量左肺组织，制备成石蜡切片进行HE染色来观察肺组织形态学改变及炎症情况，参照文献[15]报道进行分级。0级，支气管结构完整，无明显炎性细胞浸润，肺泡形态规则；1级，支气管结构较完整，少许炎性细胞浸润，肺泡形态较规则，肺泡壁无明显增厚；2级，支气管结构不完整，较多炎性细胞浸润，偶有成团，肺泡形态不规则，肺泡壁轻到中度增厚；3级，支气管结构不完整，大量炎性细胞浸润成团，肺泡形态不完整，结构被破坏，肺泡壁大面积重度增厚。石蜡切片PAS染色后，采用Image-Pro Plus 6.0软件对随机2个不同视野进行分析，得出平均光密度值(average optical, AO),AO值越大表明阳性表达越强。使用免疫组化检测试剂盒，检测肺组织Akt表达，随机选择3个不同视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件统计阳性染色值。

1.2.8 ELISA法检测肺组织VEGFA水平

按照ELISA试剂盒说明书，检测右肺组织中VEGFA水平。

1.2.9 统计学分析

通过SPSS 26.0软件进行处理，若数据符合正态分布，以

表示，方差齐性时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法(LSD)进行分析；若方差不齐，则采用塔姆黑尼法检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 乌梅丸治疗哮喘的网络药理学分析

2.1.1 乌梅丸活性成分靶点的获取

经ADME筛选后共获得乌梅8种，花椒5种，细辛8种，黄连14种，黄柏36种，附子21种，干姜5种，桂枝7种，人参22种，当归2种活性成分。乌梅靶点181个，花椒靶点164个，细辛靶点102个，黄连靶点175个，黄柏靶点200个，附子靶点17个，干姜靶点42个，桂枝靶点47个，人参靶点109个，当归靶点50个，合并后删除重复值共得到靶点229个。

2.1.2 乌梅丸与哮喘的交集靶点

在GeneCards数据库中，Asthma靶点Score最大值为71.26,最小值为0.16,中位数为1.32,设定Score>1.32的靶点为哮喘的潜在靶点，重复进行中位数筛选靶点的操作，直至靶点数<2 000,合并Bronchial asthma、Asthma靶点并删去重复值，即为GeneCards数据库中获取的哮喘靶点。合并4个疾病数据库靶点后删除重复值，最终得到2 371个哮喘相关靶点。乌梅丸与哮喘的交集靶点有146个，见图1。

2.1.3 乌梅丸成分-支气管哮喘靶点PPI网络的构建

将交集靶点提交至String 11.5平台，得到乌梅丸靶点PPI网络，见图2。将PPI tsv文件导入Cytoscape 3.9.0,根据网络拓扑学参数判断核心靶点，见表1。Akt1在网络中的连接度、介度、紧密度最高，预测Akt1为乌梅丸治疗哮喘的最核心靶点。

图1 乌梅丸与支气管哮喘交集靶点韦恩图

图2 乌梅丸作用的146个共同靶点网络关系图

表1 核心靶点网络节点特征参数

2.1.4 乌梅丸成分-支气管哮喘靶点网络图的构建

乌梅丸成分-支气管哮喘靶点网络见图3。通过Cytoscape 3.9.0中Network Analyzer分析网络拓扑学参数，得到核心成分，见表2。槲皮素连接度、介度、紧密度最高，预测槲皮素为乌梅丸治疗哮喘的最核心成分，其次为β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、原阿片碱。

2.1.5 靶点功能与通路的富集分析

GO富集分析包括生物学过程(BP)主要涉及炎症反应、细胞对有机环状化合物的反应；细胞组分(CC)主要涉及薄膜筏、膜微区等定位；分子功能(MF)主要涉及蛋白质同源二聚活性、氧化还原酶活性、蛋白质结构域特异性结合等分子功能，具体见图4。KEGG富集分析结果见图5,乌梅丸治疗哮喘主要参与的通路有PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、钙信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。

表2 乌梅丸主要活性成分网络节点特征参数

图3 乌梅丸成分-支气管哮喘靶点网络

图4 乌梅丸治疗哮喘的靶点GO功能富集分析结果

图5 乌梅丸治疗哮喘的靶点KEGG通路富集分析气泡图

2.1.6 核心成分-哮喘靶点分子对接结果

根据网络拓扑学参数得到主要活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、原阿片碱。将上述5个活性成分与其靶点进行分子对接，对接亲和力越低，成分与靶点发生作用的可能性越大，见表3。槲皮素与其作用于哮喘的91个靶点平均对接亲和力为-7.9 kcal/mol; β-谷甾醇与其作用于哮喘的25个靶点平均对接亲和力为-7.7 kcal/mol; 山柰酚与其作用于哮喘的38个靶点平均对接亲和力为-8.1 kcal/mol; 豆甾醇与其作用于哮喘的17个靶点平均对接亲和力为-8.0 kcal/mol; 原阿片碱与其作用于哮喘的14个靶点平均对接亲和力为-8.5 kcal/mol。槲皮素与MMP9分子对接结果最佳，其结合能为-10.7 kcal/mol。再将MMP9的抑制剂伊洛马司他(Ilomastat)与6ESM进行分子对接，其结合能为-9.6 kcal/mol。

表3 分子对接结果(各活性成分对接亲和力排名前5位)

2.2 动物实验验证

2.2.1 乌梅丸对哮喘小鼠肺组织病理形态的影响

2.2.1.1 HE染色

正常组气管壁及肺泡结构完整，无明显炎症细胞浸润；与正常组比较，模型组气道周围可见大量炎症细胞的浸润，支气管周围充血水肿，肺泡壁明显增厚；与模型组比较，乌梅丸各剂量组与泼尼松组气道炎症减轻，其中中剂量乌梅丸对哮喘小鼠气道炎症细胞浸润的抑制作用更加显著，见表4、图6。

表4 乌梅丸对哮喘小鼠模型肺组织病理分级程度分布的影响(只)

图6 各组小鼠肺组织HE染色(×200)

2.2.1.2 PAS染色

与正常组比较，模型组气道上皮可见大量杯状细胞，PAS阳性表达升高(P<0.01);与模型组比较，乌梅丸高、中剂量组及泼尼松组能抑制气道杯状细胞增生，PAS阳性表达降低(P<0.05),而乌梅丸低剂量组无明显变化(P>0.05),见图7、表5。

2.2.2 乌梅丸对哮喘小鼠肺组织VEGFA水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠肺组织VEGFA水平升高(P<0.01);与模型组比较，乌梅丸各剂量组及泼尼松组小鼠肺组织VEGFA水平降低(P<0.01),见表6。

图7 各组小鼠肺组织PAS染色(×200)

表5 各组小鼠肺组织PAS阳性表达比较

表6 各组小鼠肺组织VEGFA水平比较

2.2.3 乌梅丸对哮喘小鼠肺组织Akt蛋白表达的影响

Akt蛋白免疫组化显示，细胞核染色呈蓝色，阳性表达呈棕黄色，以气道周围为主。与正常组比较，模型组小鼠肺组织Akt阳性表达升高(P<0.05);与模型组比较，乌梅丸高、低剂量组及泼尼松组小鼠肺组织Akt阳性表达AO值降低(P<0.05,P<0.01),乌梅丸中剂量组Akt阳性表达降低，但差异无统计学意义(P>0.05),见图8、表7。

图8 各组小鼠肺组织Akt蛋白免疫组化染色(×200)

表7 各组小鼠肺组织Akt蛋白表达比较

3、讨论

阴阳学说是中医学重要的思维方法，阴阳失衡是疾病发生发展的根源。哮喘的发病机制复杂，“气虚-痰饮-瘀血”错杂胶结密切相关，贯穿哮喘发病整个过程，涉及多脏腑的阴阳失衡[16-17]。基于中医学“阴平阳秘、精神乃治”“本于阴阳”等相关理论，尝试从整体进行阴阳调节以实现对于哮喘的治疗。乌梅丸中乌梅疏肝平肝、酸涩收敛止咳；花椒、细辛、附子、干姜、桂枝辛燥温热，温脏驱寒，细辛兼备温肺化饮、止咳平喘之功；黄连黄柏苦寒清热；人参当归补脾益肺养血，以益久咳久喘所耗之气血。全方从整体上疏肝补脾益肺，燮理阴阳、和畅气血、通调寒热、和调枢机，具有以杂治杂的多角度、多层次的整体阴阳调理之功。

网络药理学分析发现，乌梅丸治疗哮喘的核心成分有槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、原阿片碱等。研究表明槲皮素、β-谷甾醇可改善小鼠哮喘症状，减轻气道炎症[18-19]。山柰酚、豆甾醇可抑制嗜酸性细胞浸润，对气道炎症和重塑有明显的抑制作用，豆甾醇还可抗氧化[20-21]。原阿片碱为一种异喹啉类生物碱，其具有松弛平滑肌、解痉止痛等作用[22],可能通过降低环核苷酸PDE活性从而抑制气管平滑肌的收缩[23]。

网络药理学分析发现，乌梅丸治疗哮喘的核心靶点有Akt1、IL6、VEGFA、TNF、CXCL8、PTGS2、MMP9、EGFR、FOS等。研究发现，Akt1[24]、IL6[25]、CXCL8[26]、PTGS2[27]、MMP9[28]、FOS[29]参与了哮喘气道炎症，并且IL8会刺激气道重塑，可能是哮喘患者一秒用力呼气容积加速下降的生物标志物和治疗靶点。VEGF是一种特异性的促血管内皮细胞生长因子，其可能参与了哮喘气道重建中气道平滑肌细胞增殖的过程[30]。EGFR激活诱导紧密连接蛋白1抗体的减少促进杯状细胞化生[31]。

有研究表明，激活TNF-α通路能够活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8从而诱发细胞凋亡，促使哮喘发生[32]。钙离子通路与气道炎症、气道高反应性以及气道重塑关系密切[33]。钙通道抑制剂SKF96365可抑制慢性哮喘气道重塑和气道高反应性[34]。MAPK通路介导免疫炎症细胞反应及气道结构细胞反应[35]。PI3K-Akt通路参与哮喘气道平滑肌增殖和气道重塑[36]。实验研究证实哮喘组小鼠气管炎性细胞浸润明显，HIF-1α/VEGFA通路可能参与了哮喘的发病过程[37]。

VEGFA能够促进内皮细胞在血管中的迁移和增殖，激活PI3K/Akt通路从而启动血管生成过程，并引起支气管细胞炎症[38]。因此，通过阻断VEGFA/PI3K/Akt通路可能是干预哮喘的重要途径。本实验结果表明，乌梅丸使哮喘小鼠肺组织炎性反应得到改善。PAS染色显示乌梅丸低剂量组气道上皮杯状细胞阳性表达无明显变化，可能与实验样本量较小、未达到阈剂量[39]等因素有关。泼尼松组和乌梅丸各剂量组哮喘小鼠VEGFA及Akt表达降低。

综上所述，乌梅丸可降低哮喘小鼠上调的Akt、VEGFA表达，说明乌梅丸可能通过抑制VEGFA/PI3K/Akt信号通路相关靶点的激活，降低气道炎症或气道重塑，从而达到治疗哮喘的作用。

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基金资助:国家自然科学基金面上项目(81574027); 成都中医药大学附属医院(四川省中医医院)项目(20-Q16);

文章来源:邓安妮,陈玉,薛贝贝,等.基于网络药理学及动物实验探讨乌梅丸治疗支气管哮喘的作用[J].中成药,2024,46(08):2778-2784.