关节炎是一种发生于人体关节或周围组织的一系列炎性疾病，严重甚至导致关节残疾，其发病率逐年升高，发病机制复杂[1]。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、骨关节炎(osteoarthritis, OA)、痛风性关节炎(gouty arthritis, GA)是最常见的关节炎类型，存在多种发病原因，相关分子机制复杂[2-4]。关节炎的发生发展主要与滑膜低度炎症状态、关节软骨纤维化、滑膜巨噬细胞释放炎症细胞因子有关，进一步诱导关节软骨肥大、降解和坏死，从而加重关节炎程度[5-7]。目前临床上无法根治关节炎，只能通过药物治疗维持关节功能，但单药或联合免疫抑制药物长期治疗存在较大局限性和不良反应，因此开发出天然抗关节炎药物具有重要意义。黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensisFranch.)、三角叶黄连(Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(Coptis teetaWall.)的干燥根茎[8],具有降糖、抗菌、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理作用，临床常用于治疗糖尿病、胃肠道疾病、皮肤损伤等疾病[9]。研究表明，黄连中黄连素通过抑制炎症因子水平、调节肠道菌群、促进尿酸排泄以及改善骨关节及其周围组织的炎性反应损伤，在治疗RA,OA和GA中发挥良好疗效[10-12]。网络药理学和分子对接结果表明黄连治疗关节炎具有多成分、多靶点、多通路的特点，黄连素、巴马汀、黄连碱、氧化小檗碱、药根碱等为黄连治疗关节炎的主要成分，IL-10,IL-1β,MAPK,IL-6,MMP3,TNF-α等靶点已被证明在黄连治疗关节炎中发挥重要作用。

本文通过网络药理学和分子对接技术对黄连治疗3种关节炎涉及化学成分、作用靶点及通路进行分析，揭示“药物成分-靶点-通路-疾病”之间多层次、多角度的生物网络关系，探讨黄连在治疗关节炎中发挥的作用，从而预测黄连治疗关节炎的作用机制，以期为后续研究提供科学依据。

一、材料与方法

1 黄连化学成分的筛选

通过TCMSP数据库对黄连化学成分进行筛选，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug-likeness, DL)≥0.18进行筛选[13],获得化学成分对应的靶点蛋白，并通过SwissTargetPrediction数据库对黄连化学成分进行补充，筛选出RA,OA以及GA对应的靶点。运用Uniprot数据库对靶点进行归一化及标准化处理。

2 3种关节炎疾病靶点筛选

以“rheumatoid arthritis”,“gouty arthritis”和“osteoarthritis”为关键词，在OMIM数据库,GeneCards数据库,Therapeutic Target Database数据库对RA,GA和OA潜在疾病靶点进行检索，并删除重复值。

3 构建黄连-关节炎疾病靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction networks, PPI)

将黄连化学成分靶点和3种关节炎的靶点导入VENNY 2.1数据库得到交集靶点，绘制药物与疾病靶点交集的韦恩图。将交集靶点上传至STRING 11.0数据库得到PPI网络，并将TSV格式文件导入Cytoscape软件，绘制PPI互作网络并进行网络拓扑分析，根据度(degree)值筛选关键靶点。

4 GO功能与KEGG通路富集分析

将黄连化学成分与3种关节炎的交集靶点分别导入DAVID数据库和Metascape数据库进行生物信息学分析，得出黄连治疗3种关节炎过程中相关作用通路以及生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)、分子功能(molecular function),预测黄连治疗关节炎的作用机制，为改善关节炎病理病程提供合理依据。

5 构建黄连“化学成分-疾病-靶点-通路”网络

将3种关节炎对应的化学成分、共有靶点和作用通路导入Cytoscape软件，构建“化学成分-疾病-靶点-通路”的网络拓扑结构图。

6 分子对接

从TCMSP数据库下载黄连活性成分的mol2结构格式图，在PDB数据库下载关键靶点的三维结构图并保存为pdb格式，运用PyMoL 2.6.0软件去除蛋白3D结构的配体和水分子结构，并导入AutoDockTools 1.5.7软件进行加氢和计算电荷等预处理，确定受体蛋白对接区域活性口袋后采用AutoDockTools 1.5.7软件进行分子对接，使用PyMoL 2.6.0软件对结果进行可视化处理。

二、结果

1 黄连活性成分及作用靶点

经TCMSP数据库检索，筛选获得黄连活性成分14种，检索相应靶点，未检索到相关靶点信息则删除。去重后共获得关键活性成分9种，见表1和图1。基于SwissTargetPrediction平台预测并去除重复项后，获得相关作用靶点176个。

表1黄连治疗关节炎的关键活性成分

图1黄连关键活性成分分子结构式

2 “化学成分-疾病-靶点”网络

RA,OA,GA疾病靶点通过GeneCards数据库和OMIM数据库筛选获得，分别为5 704,4 098,738个潜在靶点。取3种关节炎潜在作用靶点和黄连化学成分靶点的交集，共获得29个交集靶点，即为黄连治疗关节炎的潜在作用靶点。将靶点导入Cytoscape软件构建“化学成分-疾病-靶点”网络拓扑图，见图2。

图2黄连“化学成分-疾病-靶点”网络图

3 黄连-3种关节炎靶点的PPI网络

将176个化学成分对应的靶点、5 704个RA靶点、4 098个OA靶点和738个GA靶点导入Venny 2.1软件绘制韦恩图，见图3A。将29个交集靶点导入STRING 11.0软件获得PPI网络，共29个节点，264条边，平均节点degree值18.2,见图3B。将交集靶点导入Cytoscape软件，运用内部工具NetworkAnalyzer进行拓扑学分析，筛选degree值排名前10位的靶点(degree>19),分别为IL-1β,TNF-α,IL-6,PTGS2,MMP9,CXCL8,CCL2,PPARG,IL-10,NOS2。

图3黄连治疗3种关节炎的交集靶点图

4 GO和KEGG富集分析

根据韦恩图结果，分别将3种关节炎与黄连化学成分的交集靶点导入DAVID数据库和Metascape数据库，获得黄连治疗RA,OA,GA的生物信息分析结果。结果显示，KEGG通路分别为159,142,82条；GO分析中分子功能分别为131,116,28条；细胞组成分别为73,68,20条；生物过程分别为693,471,221条。根据P值筛选得到KEGG通路排名前20位(见图4),主要涉及癌症的发病途径通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。GO富集分析结果中，对交集靶点进行分析可知黄连调控关节炎的机制涉及基因表达正调控、药物反应和DNA模板转录调控等生物学过程以及细胞核、细胞质、大分子复合物等细胞成分，同时与酶结合、蛋白质结合、转录因子结合等分子功能有关，见图5。

图4交集靶点KEGG通路富集分析图

图5交集靶点GO富集分析图

5 关节炎疾病-靶点网络

将共有靶点和通路导入Cytoscape软件，构建“疾病-靶点-通路”的网络拓扑结构图，见图6。由图可知，黄连通过多成分和多靶点协同治疗关节炎。根据degree值大小将化学成分从高到低排序，分别为槲皮素、(R)-氢化小檗碱、巴马汀、黄连素、黄连碱、表小檗碱、氧化小檗碱、小檗红碱、甲基黄连碱。degree值排序前10位的靶点分别为IL-1β,TNF-α,IL-6,PTGS2,MMP9,CXCL8,CCL2,PPARG,IL-10,NOS2。

图6“疾病-靶点-通路”网络拓扑图

6 分子对接

将氧化小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄连素、槲皮素等活性成分与IL-1β,TNF-α,IL-6,PTGS2,MMP9,CXCL8,CCL2,PPARG,IL-10,NOS2核心靶点进行对接，结果见表2。

表2核心成分与核心靶点对接得分

结合能越低，受体与配体之间的亲和力越高，构象越稳定。各组结合能均≤-3 kcal·mol-1,表明具有良好的结合活性；结合能<-7 kcal·mol-1,表明具有较强的结合活性。核心成分与核心靶点分子对接结合能热图见图7,结果显示黄连核心成分与核心靶点均具有较高的亲和力。其中IL-1β,TNF-α,IL-6为分泌蛋白，TNF-α和IL-1β能诱导NF-κB信号通路活化，促进炎症因子IL-6表达，增加炎症细胞的活性及聚集性，加重炎症反应，在关节炎发生发展进程中发挥重要作用[15-17]。

图7分子对接热图

由于槲皮素在黄连中含量较低，不对其构建分子对接可视化图，将其他分子对接结果可视化，结果见图8。氧化小檗碱、黄连碱、巴马汀和黄连素均能与靶点形成氢键(以虚线表示),其中黄连碱与CXCL8,PTGS2和TNF-α结合能分别达到-8.18,-7.44和-7.26 kcal·mol-1,表明黄连碱与各个靶点结合最稳定。分子对接结果表明，黄连核心化学成分与治疗关节炎的核心靶点之间关联性较强。

图8黄连活性成分与核心靶点对接可视化图

以degree值排名前3位的靶点为例

三、讨论

黄连作为抗菌及抗炎中药，在治疗关节炎方面具有良好的疗效。本研究通过构建黄连活性成分-靶点网络、PPI网络及疾病-靶点-通路网络，经网络拓扑分析筛选出黄连治疗关节炎的关键靶点，degree 值排名靠前的成分主要是槲皮素、(R)-氢化小檗碱、巴马汀、黄连素、黄连碱、表小檗碱、氧化小檗碱、小檗红碱、甲基黄连碱，degree值排名靠前的靶点分别为IL-1β,TNF-α,IL-6,PTGS2,MMP9,CXCL8,CCL2,PPARG,IL-10,NOS2。黄连素是黄连中抗菌及抗炎的主要成分，通过减轻细胞炎症、改善软骨细胞功能、促进软骨合成及修复和促进尿酸排泄等多种生物过程改善关节炎[18]。巴马汀可显著阻断Wnt/β-catenin信号通路，对软骨细胞和膝关节软骨起保护作用，抑制骨关节炎的进展[19]。黄连中槲皮素、表小檗碱和小檗红碱在治疗关节炎中发挥的作用尚不明确。研究表明，槲皮素能够减轻关节炎小鼠炎症指数、减轻关节破坏以及软骨细胞炎症，改善骨关节炎[20]。此外，黄连中未被验证的表小檗碱等化学成分可作为潜在治疗成分进行深入研究。CXCL8,CCL2,IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-10等靶点已被证实在黄连治疗关节炎中发挥关键作用[21-24]。TNF-α是由成膜纤维细胞分泌的促炎细胞因子，主要分布在RA患者关节间隙，目前TNF-α疗法是重症RA患者的首选疗法[15]。IL-6在RA的发生发展中起重要作用[16],并且与OA发病中的炎症反应以及软骨损失有关[17]。Peyronnel等[25]研究表明在佐剂性关节炎中CCL2 mRNA表达增加，且在发病时表达量达到最大值。巨噬细胞衍生的IL-10可以通过调节NF-κB受体激活蛋白配体/护骨因子(receptor activator of NF-κB ligand/osteoprotegeri, RANKL/OPG)相互作用引发对金黄色葡萄球菌诱导的脓毒性关节炎的保护作用[26]。

KEGG分析结果表明黄连治疗关节炎过程中涉及癌症的发病途径通路、IL-17信号通路、TNF信号通路及Hepatitis B通路等，参与的作用靶点CXCL8,MAPK1,TNF-α,IL-6和CCL2等已被证实与关节炎发生发展相关[27-30]。Snelling等[31]已验证调控软骨细胞中IL-17信号通路可抑制关键蛋白IL-17受体A(interleukin-17 receptor A,IL-17RA)、核转录因子-κB激活剂1(activator 1 of nuclear transcription factor-κB,ACT1)和肿瘤坏死因子受体相关因子 6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)等过度表达及活化，可改善OA软骨炎症。IL-6,AKT,MAPK,VEGFA等作用靶点以及PI3K/AKT,HIF-1α等信号通路已被证实在黄连治疗关节炎中发挥作用，黄连素通过抑制RANKL诱导的AKT磷酸化防止软骨破坏[32],通过调控HIF-1α信号通路抑制HIF-1α表达和调节巨噬细胞的能量代谢，从而发挥抗炎作用，并改善佐剂性关节炎[33]。黄连中黄连素、巴马汀、药根碱等多种成分可有效改善关节炎，网络药理学研究结果表明黄连与关节炎共有29个共同靶点，主要与槲皮素、黄连素以及巴马汀等10种化学成分有关。研究结果表明，CCL-2,MMP3,TGF,MAPK,IL-6,IL-10,CXCL8等作用靶点与关节炎的病理过程有关。

总而言之，本文通过网络药理学研究分析得出，黄连可能通过槲皮素、(R)-氢化小檗碱、巴马汀、黄连素、黄连碱、表小檗碱、氧化小檗碱、小檗红碱、甲基黄连碱等多种活性成分治疗关节炎，其中黄连素、巴马汀、黄连碱等6种化学成分已被证实在治疗关节炎方面具有良好的疗效。黄连化学成分与3种关节炎的交集靶点共29个，CCL2,IL-6,MMP3,CXCL-8,MAPK1等靶点已被证实在治疗关节炎中发挥作用[34];AHR,CAV1,CRP,CXCL2,IRF1,SPP1等靶点在关节炎发病中发挥重要作用，可作为治疗关节炎关键靶标，但其在黄连治疗关节炎中的作用还有待进一步验证，后续可利用分子对接验证其关键活性成分和核心靶点的相互作用。本文通过网络药理学和分子对接分析了黄连在治疗关节炎过程中涉及活性成分、作用靶点及通路，探讨了相关作用机制和潜在靶标，为黄连治疗关节炎提供了一定的理论基础。

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(81973699,82274361);

文章来源:李梦园,郭金玲,姚静雯,等.基于网络药理学及分子对接探究黄连治疗关节炎的作用机制[J].中国新药杂志,2024,33(16):1699-1707.