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氯化两面针碱潜在靶标极光激酶A在结直肠癌组织中临床病理价值

2024-08-12 15 上传者：管理员

摘要：目的：探究极光激酶A(AURKA)在结直肠癌中的临床病理价值。方法：通过分子对接探究AURKA与氯化两面针碱(NC)结合强度。结合免疫组织化学数据和全球高通量数据集分析结直肠癌中AURKA蛋白和mRNA表达水平，计算标准平均偏差(SMD)和总结受试者操作特征(sROC),以探讨AURKA在结直肠癌和放疗抵抗中综合表达水平，利用CRISPR敲除筛选以及体外敲低AURKA后的基因芯片数据，分析AURKA促癌潜在分子机制。结果：AURKA与NC结合能为-10kcal/mol, AURKA蛋白在结直肠癌中表达上调，mRNA在2 511个结直肠癌样本和41个放疗抵抗样本中表达上调，显示结直肠癌中SMD为2.07,放疗抵抗中SMD为0.73。敲低AURKA在结直肠癌LS123细胞系中生长抑制最显著。体外敲低AURKA mRNA后基因主要富集于肌动蛋白、线粒体膜、细胞周期检查点通路。结论：在结直肠癌中，AURKA是潜在的NC和放疗增敏靶点，下调AURKA有望用于临床治疗。

关键词：
总结受试者操作特征
放疗
极光激酶A
标准平均偏差
氯化两面针碱
结直肠癌
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氯化两面针碱(Nitidine chloride, NC)是一种天然生物活性植物化合物生物碱，从中药两面针中提取获得。本研究小组前期发现NC显示出含抗肿瘤在内的多种生物学活性[1-2]。其在结直肠癌中可通过细胞色素C介导的线粒体凋亡途径诱导HT29细胞凋亡[3],也可抑制ERK信号从而影响结直肠癌细胞的增殖和干性[4],但NC可能通过调节多个未知的信号通路和靶点而发挥抗结直肠癌作用。通过网络药理学的预测方法，课题组前期发现极光激酶A(Aurora kinase A, AURKA)有可能成为NC作用的潜在靶基因。AURKA在一项基于生物信息学的小样本研究中被发现为结直肠癌的核心基因[5],AURKA也对结直肠癌的迁移和浸润等有促进作用。但AURKA在结直肠癌发生及发展中的作用及是否能成为NC的潜在靶点尚有待进一步深入研究。故本研究通过计算全球高通量数据，明确AURKA在结直肠癌进展中的临床价值，并结合CRISPR knockout screens(CRISPR敲除筛选)以及体外敲低AURKA后的基因芯片数据，综合分析其促癌潜在分子机制。

1、材料与方法

1.1 NC潜在靶标AURKA的分子对接

首先本研究通过SwissTargetPrediction数据库预测NC可能的作用靶点。获得AURKA后，从RCSB PDB数据库下载其晶体结构(PDB ID:7ZTL),同时从PubChem数据库下载分子结构，由ChemBio3D Ultra完成自由能最小化，利用AutoDockTools和QuickVina-w软件完成分子对接，分子对接的结果以affinity展示，对接模型由PyMOL进行可视化。

1.2 AURKA表达的临床病理意义

1.2.1 AURKA在结直肠癌组织中的蛋白表达水平。

THE HUMAN PROTEIN ATLAS(THPA)使用了两个AURKA的免疫组化抗体(HPA002636及CAB001454)进行非癌结肠、非癌直肠以及结直肠癌组织的AURKA蛋白表达检测。组织样本由瑞典乌普萨拉大学医院病理学系提供。在对代表性HE切片进行镜下确诊后，选择相应组织块，取直径为1mm的组织制作成组织芯片。切片后进行了免疫组织化学染色，并扫描成数字图像。AURKA蛋白定位于细胞核、细胞浆及细胞膜中，本研究通过分析阳性细胞染色强度(无染色、轻度染色、中度染色、重度染色)、综合阳性细胞数量(0%、25%、50%、75%)情况将每个病例分为阴性、低度阳性、中度阳性和高度阳性四个等级。将THPA获得的AURKA蛋白表达数据作为等级资料使用，结合SPSS23.0软件的非参数Wilcoxon检验进行分析。

1.2.2 AURKA在结直肠癌组织中的mRNA表达水平及临床价值。

从Gene Expression Omnibus(GEO)、TCGA和Genotype-Tissue Expression(GTEx)等公共高通量数据库中收集结直肠癌和非癌肠组织的mRNA表达数据集，同步收集结直肠癌放疗相关数据集。纳入标准：(1)数据集来源于人类组织或者细胞；(2)数据集同时具有实验组及对照组，且每组样本数≥3。排除标准：(1)重复的数据集；(2)非转录组数据集；(3)无表达矩阵的数据集。对所得的数据集分别进行对数转换，合并平台矩阵，用sva包去除批次效应。在使用Stata 16.0的标准均值差(Standard mean deviation, SMD)计算中，若I2> 50%或P<0.05,则选择随机效应模型，反之选择固定效应模型，研究整合的AURKA mRNA表达情况，并使用Begg’s和Egger’s检验检查SMD模型下的发表偏倚。结合综合受试者工作曲线(summary receiver operator curves, sROC)进一步对AURKA mRNA在不同组别的表达差异进行验证，并计算其灵敏度、特异度、阴性似然比及阳性似然比。

1.2.3通过CRISPR高通量敲除筛选研究AURKA与结直肠癌细胞生长的关系。

本研究收集来自Broad的Achilles和Sanger的SCORE项目发布的在多种结直肠癌细胞中进行的CRISPR敲除筛选数据产生的靶向AURKA基因的效应分数。负分代表基因敲除后细胞生长受阻和(或)死亡，效应分数由Cancer Dependency Map (DepMap)计算[6]。

1.2.4使用siRNA敲低AURKA后探讨其相关信号通路。

通过上述挖掘高通量数据集的检索方式，本研究发现编号为GSE108320的数据集，包含对结直肠癌细胞系(Caco2,SW480)的AURKA使用siRNA敲低后进行基因芯片检测数据。通过计算差异基因，获得结直肠癌体外敲低AURKA后直接受到影响的基因。使用Pearson相关性分析，在所有包含AURKA表达值的结直肠癌高通量数据集中计算所有基因与AURKA之间的相关性，选择|相关性|≥0.30且P<0.05的基因作为AURKA在结直肠癌组织中的表达相关基因。再通过计算以上高通量数据集所有基因的SMD,获得结直肠癌组织中的表达差异基因。继而将体外与组织AURKA正相关的基因交集组织高表达者，结合clusterProfiler包和ReactomePA包，进行基因本体(Gene Ontology, GO),Reactome分析。

1.3统计学方法

各实验使用的具体统计学方法见上，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 AURKA可能是NC的一个潜在靶标

通过SwissTargetPrediction预测显示AURKA可能是NC的作用靶点后，本研究将AURKA和NC进行了分子对接。AURKA和NC分子对接的结合能为-10kcal/mol(见图1),提示AURKA与NC有较强的结合潜能。

图1NC与AURKA的分子对接结果

2.2 AURKA表达在结直肠组织中的临床病理意义

2.2.1 AURKA蛋白在结直肠癌组织中的表达水平升高趋势。

THPA中两个AURKA的免疫组化抗体均显示AURKA蛋白在结直肠癌组织中具有表达上调的趋势。其中HPA002636在3例非癌结肠及直肠中AURKA表达均为阴性(低表达率为0.00%, 0/3),在9例结直肠癌组织中，超过半数为阳性低表达(低表达率为55.56%,5/9),在结直肠癌中，AURKA蛋白表达显著增高(P=0.036)。而CAB001454染色结果显示，非癌结肠及直肠中表达均为低表达，未见中度及高度表达的情况(中高表达率为0.00%,0/6),在结肠癌中，则有2例中表达，2例高表达(中高表达率为33.33%, 4/12),同样AURKA蛋白在结直肠癌中的表达比非癌对照显著增高(P=0.010),见图2。

图2结直肠癌中AURKA mRNA综合表达水平

2.2.2 AURKA mRNA在结直肠癌中表达水平。

在含有2 511个结直肠癌样本和1 356个非结直肠癌样本的45个数据集合并的20个平台数据集中，综合表达分析显示，基于随机效应模型，AURKA mRNA综合表达为上调(SMD=2.07,95%CI 1.62～2.51),见图2a。sROC下AUC为0.96,AURKA mRNA显著上调(见图2b)。Begg’s和Egger’s均无发表偏倚(P>0.05),见图2c、d。AURKA mRNA高表达的灵敏度为0.90、特异度为0.92、阳性似然比为11.99,阴性似然比为0.11(见图3a、b)。

2.2.3 AURKA与结直肠癌放疗作用的关系。

综合分析显示，在固定效应模型下，AURKA在41个放疗抵抗样本中的综合表达上调(SMD=0.73,95%CI 0.09～1.37),见图4a; Begg’s和Egger’s均无发表偏倚(P>0.05),见图4b、c。

2.3 CRISPR高通量敲除筛选显示敲除AURKA后结直肠癌细胞生长受抑

56种结直肠癌细胞系在敲除AURKA mRNA后，均呈现出肿瘤细胞生长受阻和/或死亡的现象，其基因效应分数均低于0。其中作用效果最显著的是于1974年从一名65岁的白人女性结肠癌患者组织中分离得到的细胞系LS123(见图5)。

2.4体外敲低AURKA mRNA的信号通路分析

为了进一步探究AURKA在结直肠癌中的调控分子病理机制，本研究获取了潜在的AURKA相关基因进行富集分析。AURKA在结直肠癌中的负相关基因包括来自siAURKA作用下Cao2和SW480中7 409个、8 333个上调基因，与45个结直肠癌mRNA数据集中2 534个AURKA表达负相关基因、6 125个下调基因交集获得的91个基因(见图6a),这些基因富集于actin binding等GO通路(见图6c)。同时，AURKA在结直肠癌中的正相关基因含来自siAURKA作用下Cao2和SW480中8 446个、7 694个下调基因，与高通量数据集中3 144个AURKA mRNA正相关基因、5 837个上调基因的148个交集基因(见图6b),这些基因富集于mitochondrial outer membrane、mitotic intra-S DNA damage checkpoint signaling等GO通路(见图6d),以及Cell CycleCheckpoints、FLT3 Signaling等Reactome通路上(见图6e)。

3、讨论

作为中华民族医药中的瑰宝，NC在抗癌上逐渐发挥显著作用，而AURKA作为其潜在靶点，在结直肠癌中的临床病理价值尚未被报道。本研究首先利用分子对接发现AURKA可能是NC的潜在靶点，结合免疫组化和高通量数据发现结直肠癌中AURKA蛋白和mRNA表达均显著上调，且AURKA还可能是潜在的放疗抵抗基因，使用CRISPR敲除筛选发现AURKA在多个结直肠癌细胞系中均具有促生长作用。

结直肠癌中，AURKA可能是NC潜在的治疗靶点。NC作为天然的植物生物碱，在部分肿瘤的治疗中展示出了潜在的临床应用价值。NC能够通过抑制ERK信号通路来抑制结肠癌细胞的增殖并诱导凋亡[4]。但NC治疗结直肠癌的分子靶点并未完全得到揭示，研究NC的分子靶标对于结直肠癌的治疗具有重要意义。本研究首次发现了结直肠癌中的核心基因AURKA也是NC的潜在靶点，而高表达的AURKA在多种癌症中表现出耐药性[7]。NC的出现为通过AURKA有效治疗耐药性结直肠癌提供了新的可能。

AURKA在结直肠癌中上调可促进肿瘤生长。AURKA作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节细胞中有丝分裂纺锤体的功能[8]。ARID3A通过上调AURKA促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[9]。当然，AURKA在放疗抵抗中表达的上调，会降低放疗的作用效果，敲除AURKA能够增加结直肠癌细胞对于放疗的敏感性，抑制细胞的增殖[10]。在本项研究中，我们首次结合多中心多平台数据观察到AURKA蛋白和mRNA水平均呈显著的高表达，敲除AURKA则造成多种结肠癌细胞系生长抑制，高表达的AURKA可能是结直肠癌细胞增殖的关键因子。值得注意的是，在含结直肠癌放疗抵抗样本的高通量数据中，AURKA呈现高表达状态，其也可能是潜在的放疗抵抗基因。临床上针对高表达AURKA结直肠癌患者的治疗，下调AURKA表达可能是抑制疾病发展，增加放疗敏感，提升治疗效果的新选择，而NC就是一个有临床应用潜能的药物单体。

图3结直肠癌中AURKA mRNA综合灵敏度、特异度、阴阳似然比图

图4结直肠癌中AURKA mRNA在放疗效果数据集中综合表达

AURKA在结直肠癌中的分子机制的研究可协助解释其在肿瘤生物学途径中的调控作用。肌动蛋白对于细胞迁移起着重要作用，在乳腺癌中，AURKA对Cofilin-F-肌动蛋白通路的激活可能会诱导乳腺癌细胞的迁移和侵袭[11]。本研究发现AURKA在结直肠癌中也可能通过调控肌动蛋白来影响细胞迁移。此外，细胞周期作为细胞遗传调控的重要环节，是癌症发生的驱动力，其失控往往会导致细胞增殖不受限制[12]。上调的AURKA促进结直肠癌细胞的生长和增殖可能与其在细胞周期检查中的潜在作用有关。Fms样酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3,FLT3)与AURKA联合抑制剂在结直肠癌中展现出了有效的抗癌作用，但对于磷酸酶和张力蛋白同源物基因突变型结直肠癌的作用效果较差，这可能与耐药性有关[13]。针对耐药性的结直肠癌，NC可能有着有效的治疗效果。有趣的是，在本研究中，AURKA在线粒体膜的潜在作用提示NC可能通过作用结直肠癌细胞的线粒体膜，进而影响AURKA的表达水平，从而达到治疗结直肠癌的目的，这也为耐药性结直肠癌提供新的治疗方案。进一步明确AURKA在结直肠癌中的潜在分子机制有望提供更加精准的治疗方案。

图5CRISPR高通量敲除筛选探讨AURKA与结直肠癌细胞生长的关系

基因效应分数由DepMap(https: //depmap.org/portal/)提供

图6体外敲低AURKA mRNA潜在信号通路分析

本研究针对中国传统中药进行挖掘，从NC的自身特点出发，发现作为NC靶基因以及结直肠癌的核心基因AURKA的促癌作用，展示了其可能是潜在的放疗抵抗基因，为临床上使用NC治疗结直肠癌，特别是放疗抵挡的结直肠癌患者提供了新的实验证据。

参考文献:

[3]黄燚燚,秦悦,谢雪平,等.氯化两面针碱通过细胞色素c介导的线粒体凋亡途径诱导人结肠癌HT29细胞凋亡[J].广西医科大学学报,2018,35(4):426-430.

[5]曾成,祁国萍,沈颖,等.基于生物信息学的结肠癌核心基因筛选及验证[J].江苏大学学报(医学版),2021,31(4):296-302.

基金资助:国家级大学生创新创业项目(202210598022);

文章来源:姚锦联,熊丹丹,谢富香,等.氯化两面针碱潜在靶标极光激酶A在结直肠癌组织中的临床病理价值[J].医学理论与实践,2024,37(15):2533-2538.