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lnc RNA UCA1在急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义

2024-07-29 25 上传者：管理员

摘要：目的：检测急性髓系白血病（AML）患者骨髓中尿路上皮癌胚抗原1(lncRNA UCA1)的表达水平，并探讨lnc RNA UCA1表达水平在AML患者中的临床意义。方法：收集50例AML患者骨髓标本作为实验组和20例缺铁性贫血（IDA）患者骨髓标本作为对照组，并收集AML患者的相关临床病理特征资料。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测lnc RNA UCA1在实验组和对照组中的表达水平，并分析lnc RNA UCA1在AML患者中的表达水平与临床病理特征及预后的关系。采用Kaplan-Meier曲线分析lnc RNA UCA1表达水平对AML患者总体生存时间（OS）的影响；采用Cox风险回归模型分析影响AML患者预后的因素。结果：与对照组相比，lnc RNA UCA1表达水平在AML患者中明显升高（P<0.001）;lnc RNA UCA1高表达组中血红蛋白低于90 g/L的患者占比明显高于低表达组（P=0.004）;lnc RNA UCA1在M1、M2和M4型AML患者中表达水平较高，而在M0、M5型AML患者中表达水平较低，差异具有统计学意义（P=0.009）。lnc RNA UCA1高表达组患者与低表达组患者的性别、年龄、WBC计数、PLT计数、骨髓原始细胞比例、化疗方案及疗效、核型、基因突变及预后风险分层的差异均无统计学意义（均P>0.05）;lnc RNA UCA1高表达组患者的OS较低表达组患者显著缩短（P=0.0229）。结论：lnc RNA UCA1表达水平在AML患者中明显上调，其高表达与较差的临床病理特征及不良预后相关，可作为判断AML患者预后的指标和潜在的治疗靶点。

关键词：
lncRNA UCA1
临床意义
异常增殖
急性髓系白血病
骨髓造血干/祖细胞恶性肿瘤
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急性髓系白血病（AML）是一种骨髓造血干/祖细胞恶性肿瘤，以骨髓和外周血中原始细胞的异常增殖为特征，是成人急性白血病中最常见的类型[1]。虽然临床上强化化疗和同种异体造血干细胞移植取得了较大的进展，但由于疾病的难治性、复发性和耐药性等特点，导致大多数AML患者的预后仍较差，其5年生存率仅约为24%[2]。因此，为了改善AML患者的预后，探寻潜在的敏感分子标志物就显得尤为重要。近年来，RNA的亚细胞定位作为一种影响许多细胞过程的技术手段受到了极大的重视[3]。文献报道，长链非编码RNA(lnc RNA）是一种新兴的癌症生物学功能调节剂，可以作为潜在的癌症诊断、预后和靶向治疗的生物标志物[4]。尿路上皮癌胚抗原1(UCA1）属于一种lnc RNA,由于其在胚胎发育和多种肿瘤组织和细胞中的异常表达，近年来受到了越来越多的关注。研究表明，UCA1在肿瘤生长和转移中发挥促进作用，并且它可能作为多种实体肿瘤和恶性血液系统疾病的潜在生物标志物和治疗靶点[5]。然而，UCA1在AML临床诊疗中的作用尚未明确。本研究检测了AML患者和缺铁性贫血（IDA）患者中lnc RNA UCA1的表达水平，并分析其在AML患者中的表达水平与临床病理特征及预后的关系，以期为AML患者的预后判断和潜在治疗靶点研究提供参考。

1、材料和方法

病例资料

收集2019年1月至2020年12月蚌埠医学院第一附属医院血液内科收治的50例AML患者（实验组）和20例IDA患者（对照组）的骨髓标本和详细临床资料，如性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、FAB分型、核型、基因突变、化疗方案、疗效判断和预后分层等信息。纳入患者均签署了知情同意书，本研究经蚌埠医学院第一附属人民医院伦理审查委员会批准。

试剂与仪器

TRIzol试剂、M-Mu LV第一链c DNA合成试剂盒、2X SG Fast q PCR预混液（低Rox）试剂盒及相应引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。Applied Biosystems PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

RNA样本的提取

骨髓血标本2 ml置于EDTA-K2管中，使用红细胞裂解液、生理盐水、TDZ5A-WS台式低速离心机（常州德科仪器制造有限公司）经裂解、离心、洗涤等步骤提取单个核细胞，然后使用TRIzol试剂、氯仿、异丙醇等提取总RNA，使用SMA1000超微量分光光度计（北京美林恒通）测量总RNA的纯度与浓度，并收集OD260/OD280比值在1.8-2.0之间且浓度在30-70 ng/μl之间的总RNA样本。

实时荧光定量PCR(q RT-PCR）法检测UCA1表达水平

按照试剂盒说明书反转录出c DNA，在PCR仪上扩增特定DNA片段。每个样本均设置3个复孔进行对照，计算其均值，实验组与对照组均以GAPDH作为内参基因，采用2-△△Ct法计算UCA1基因相对表达水平。UCA1上游引物5′-CACTCTTTGCCAGCCCT CAGCTT-3′，下游引物5′-AGGTGTGAGTGGCGGTCT GAAT-3′；GADPH上游引物5′-GTCTCCTCTGACTTC AACAGCG-3′，下游引物5′-ACCACCCTGTTGCTGTA GCCAA-3′。

基因突变检测和染色体检查

将患者骨髓标本送至合肥金域医学检验实验室进行二代测序和染色体检查。

采用荧光定量PCR技术检测突变基因：运用二代测序技术进行基因组DNA的提取，首先对DNA进行片段化处理，然后在片段化处理后的DNA片段末端添加A尾及接头，再通过PCR扩增富集文库，最后运用探针杂交，从而获得目的基因序列。

染色体检查方法为细胞培养+G显带染色体核型分析。具体操作：骨髓细胞经过24 h培养后，收集细胞常规制片，将制好的染色体标本烤干后放入胰酶溶液中消化，然后置于Giemsa染液中染色，用自来水冲洗干净，晾干后即可阅片。镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本，在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本。

临床疗效评定及随访

本研究中AML患者的临床疗效均根据《中国成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）诊疗指南（2021版）》[6]进行评定。50例AML患者出院后均进行了随访，随访起点时间为确诊日期，随访截止时间为2021年12月31日。患者的总生存时间（OS）定义为自确诊至因任何原因死亡或随访截止的时间。

统计学分析

应用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 9.0软件进行数据处理和统计学分析。组间比较采用t检验，lnc RNA UCA1的表达水平与临床病理特征之间的关系采用卡方检验或者Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法评估lnc RNA UCA1的表达水平对患者OS的影响，采用Cox比例风险模型分析影响AML的预后因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

AML患者中lnc RNA UCA1的表达情况

本研究采用q RT-PCR法检测lnc RNA UCA1在实验组和对照组中的表达水平，并进行t检验，分析两组间lnc RNA UCA1表达水平的差异，结果显示，lnc RNA UCA1在AML患者中的表达水平较对照组明显增高，差异具有统计学意义（P<0.001）（图1）。

Figure 1.Expression of lnc RNA UCA1 were measured by q RT-PCR in 50 cases of acute myeloid leukemia (AML)patients (AML group) and 20 cases of iron deficiency anemia (IDA) patients (control group).

lnc RNA UCA1的表达与AML患者临床病理特征之间的关系

50例AML患者中，男性26例，女性24例；急性髓细胞白血病微分化型（M0)1例、急性粒细胞白血病未分化型（M1)4例、急性粒细胞白血病部分分化型（M2)20例、急性粒单核细胞白血病（M4)10例和急性单核细胞白血病（M5)15例。患者的其他临床病理特征，如年龄、白细胞计数（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）计数、骨髓原始细胞占比等相关数据分别取中位值作为分界的标准。年龄以70岁为界，高者13例，低者37例；白细胞计数以25×109/L为界，高者18例，低者32例；血红蛋白以90 g/L为界，高者20例，低者30例；血小板计数以50×109/L为界，高者20例，低者30例；骨髓原始细胞比例以65%为界，高者23例，低者27例。lnc RNA UCA1高表达组中低血红蛋白的患者比例明显高于低表达组（P=0.004);lnc RNA UCA1在M1、M2和M4型患者中表达水平较高，而在M0、M5型患者中表达水平较低（F=11.711,P=0.009）；而lnc RNA UCA1表达水平与性别、年龄、WBC、PLT计数及骨髓原始细胞比例无明显相关性（表1）。

50例AML患者中，采用IA（去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷）化疗方案者23例，DA（柔红霉素+阿糖胞苷）化疗方案者21例，CAG（阿克拉霉素+阿糖胞苷+粒细胞集落刺激因子）化疗方案者6例；临床疗效评估结果显示，达完全缓解（complete remission,CR）者10例，部分缓解（partial remission,PR）者15例，未缓解（no remission,NR）者25例。lnc RNA UCA1表达水平与化疗方案（F=3.910,P=0.145)及疗效（χ2=1.040,P=0.595）之间无明显相关性（表2）。

50例AML患者中，核型正常的患者30例，核型异常（包括数目异常和结构异常）的患者20例；伴有CEBPA、NPM1、FLT3-ITD、NRAS or KRAS、DNMT3A、IDH1/2、ASXL1、SRSF2、TP53等基因突变的患者30例，无基因突变的患者20例；根据急性髓系白血病诊疗指南[6]将患者分为预后良好组6例，预后中等组9例，预后不良组35例。统计结果显示，lnc RNA UCA1表达水平与核型、基因突变及预后风险分层之间均无明显相关性（P>0.05）（表3）。

lnc RNA UCA1表达水平与AML患者预后的关系

Kaplan-Meier生存曲线分析50例AML患者的总体生存时间（OS）,结果显示，lnc RNA UCA1高表达患者的OS较低表达患者明显缩短（χ2=5.178,P=0.0229）（图2）。这表明，lnc RNA UCA1的过表达会影响患者的生存期，可作为判断患者预后不良的潜在指标。

影响AML患者预后的多因素分析

将患者的临床病理特征资料纳入到多因素Cox风险回归模型中进行分析，结果显示，性别（P=0.517）、年龄（P=0.403）、WBC计数（P=0.890）、Hb(P=0.575）、PLT计数（P=0.495）、核型（P=0.119）、基因突变（P=0.150）和预后风险分层（P=0.463）与患者的预后无明显相关性；而骨髓原始细胞比例升高（P=0.012）及lncRNA UCA1表达水平升高（P=0.013）是影响AML患者预后的风险因素（表4）。

3、讨论

最早Wang等[7]首次报道尿路上皮癌胚抗原1(UCA1）在膀胱癌组织样本和尿液沉淀物中脱落的上皮细胞中高表达，在16种正常组织（心、脑、肺、肝、肌肉、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、白细胞、胎盘）中，UCA1仅在胎盘组织中出现高表达，且随着胎儿的成长，UCA1在人体内的表达逐渐降低直至消失。随着研究的不断深入，逐渐发现UCA1在多种实体肿瘤中与较差的临床病理特征和不良预后相关，如结肠直肠癌、膀胱癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、肝细胞癌和宫颈癌等[8-11]。有研究针对骨肉瘤患者的循环lnc RNA UCA1表达水平进行了分析，结果显示，骨肉瘤患者的外周血lnc RNA UCA1表达上调，且高表达水平的lnc RNA UCA1与较低的总生存率相关，是预测患者预后不良的独立指标[12-13]。

此前已有大量研究探讨了lnc RNA UCA1与AML发生发展之间的作用机制，如lnc RNA UCA1可通过调节急性髓系白血病细胞中的mi R-296-3p/Myc轴[14]、上调mi R-204使SIRT1信号失活[15]、作为mi R-96-5p的海绵上调其靶标ATG7[16]，或者通过上调CXCR4和CYP1B1的表达[17]来促进AML的发生发展。有研究通过转录组测序、生物信息学分析和临床验证确认lnc RNA UCA1可以作为预测AML生存预后的公认生物标志物[18]。但lnc RNA UCA1在AML患者中的表达与临床病理特征之间的关系尚未见报道。

本研究结果显示，lnc RNA UCA1高表达会导致AML患者总体生存期（OS）缩短；lnc RNA UCA1高表达组中低血红蛋白的患者比例明显高于低表达组，表明lnc RNA UCA1与更差的临床病理特征相关；多变量Cox回归分析表明，lnc RNA UCA1表达水平升高、较高的骨髓原始细胞比例是影响AML患者预后不良的独立危险因素。本研究还发现，lnc RNA UCA1在M1、M2和M4型患者中表达水平较高，而在M0、M5型患者中表达水平较低，这在之前的队列研究中未见报道。

本研究也存在一定的局限性，如随访时间相对较短，样本量相对较小，且本研究只评估了基线时lnc RNA UCA1的表达水平，而没有研究治疗后lnc RNA UCA1表达水平的变化，因此，后续需要延长随访时间和扩大样本量来进一步验证目前的结果。

总之，lnc RNA UCA1高表达与AML患者较差的临床特征和不良预后相关，表明lnc RNA UCA1有望作为判断AML患者预后的指标和潜在的治疗靶点。

参考文献:

6中华医学会血液学分会白血病淋巴瘤学组.中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)诊疗指南(2021年版).中华血液学杂志,2021,42(8):617-623.

文章来源:白雪,伍燕平,李忠玉,等.lnc RNA UCA1在急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义[J].中国实验血液学杂志,2024,32(04):999-1004.