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不明原因肺炎病例中多种病原体混合感染情况分析

2024-07-01 17 上传者：管理员

摘要：目的分析贵阳市不明原因肺炎多种病原体混合感染情况，为完善不明原因肺炎预防控制及临床诊疗提供依据。方法通过实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescence PCR)对2020—2022年不明原因肺炎病例的咽拭子和痰液标本进行检测，在常规监测的人感染高致病性禽流感病毒和SARS冠状病毒的基础上，同时加入非常规监测的易引起肺炎症状的多种呼吸道病毒和细菌进行检测。结果 457份标本中，病毒与细菌混合感染66份，感染率为14.4%;病毒与病毒混合感染9份，感染率为2.0%;细菌与细菌混合感染27份，感染率为5.9%。不同病原体混合感染的检出率差异有统计学意义(χ2=53.955,P<0.001)。3种病原体混合感染标本14份，占3.1%,呼吸道合胞病毒和流感嗜血杆菌混合感染最多，共40份，占8.8%,流感嗜血杆菌和肺炎链球菌混合感染24份，占5.3%。结论贵阳市不明原因肺炎病例中存在多种病原体混合感染情况，以病毒与细菌混合感染为主。

关键词：
不明原因肺炎
多种病原体
实时荧光聚合酶链反应
混合感染
肺炎监测系统
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2003年SARS疫情后，2004年原卫生部制定了《全国不明原因肺炎病例监测实施方案(试行)》,并在全国创建了不明原因肺炎监测系统[1],要求各省市在各级各类医疗机构尤其是二级以上医疗机构中开展不明原因肺炎病例监测工作，主要是为早期发现SARS、人禽流感病例和其他以肺炎为主要临床表现的聚集性呼吸道传染病。由于呼吸道病原体的多样性和易感性，导致在常规监测项目中无法找出导致病例出现严重肺炎症状的主要病原体，使病例得不到及时有效的治疗。本次研究通过实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescence PCR)对贵阳市2020—2022年457份不明原因肺炎病例标本进行核酸检测，在常规监测项目中同时增加呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒等6种病毒，及流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌等9种细菌的核酸检测。分析检测结果，以了解贵阳市不明原因肺炎多种病原体混合感染情况，为完善贵阳市不明原因肺炎预防控制机制及其临床诊疗提供实验室依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源

贵阳市2020—2022年各综合医院及各区县疾控中心报告并采集的457份不明原因肺炎病例咽拭子或痰液标本。本研究项目研究者资格经验符合要求，研究方案科学，已经过伦理委员会审核。

1.1.2主要仪器

全自动核酸提取仪KINGFISHER FLEX(赛默飞世尔科技公司，美国);实时荧光PCR仪QuantStudio 7 Flex(赛默飞世尔科技公司，美国)。

1.1.3试剂

核酸提取试剂(批号：221130N0T183,西安天隆生物科技有限公司，中国);甲型/乙型流感病毒通用(批号：20220929A)、H7N9禽流感病毒(批号：20211125A)、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒(EMC型)核酸检测试剂盒(批号：20220918A,中山大学达安基因有限公司，中国);2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒(批号：20221207A,上海伯杰生物科技有限公司，中国);其他病毒及细菌核酸检测试剂盒(批号：20220919A,上海之江生物科技股份有限公司，中国)。

1.2方法

1.2.1标本前处理

收集不明原因肺炎病例咽拭子标本，按顺序编号，3 500r/min离心5min,待离心结束，将标本转移至二级生物安全柜，用移液枪吸取1.5ml上清液置于离心管，进行病毒核酸检测；再弃去多余上清液，只保留0.5ml于试管，进行细菌核酸检测。常规监测项目24h内上报核酸检测结果，若不能及时进行其他项目监测，将标本置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.2病毒核酸提取

应用总核酸提取试剂盒提取标本中病毒及细菌总核酸。

1.2.3 Real-time fluorescence PCR检测

病毒：按试剂盒说明，分别在八联管中加入17μl PCR反应液A和3μl PCR反应液B,再加入5μl待检标本核酸，并同时设置阴/阳性对照及弱阳性质量控制，反应体系为25μl,混匀，上机，扩增条件为50℃15min; 95℃15min; (94℃15sec; 55℃45sec采集荧光)40次循环，荧光通道检测选用羧基荧光素或羧基荧光素和6-羟基吡啶-2-羧酸通道。

细菌：分别取所需量的核酸实时荧光PCR检测混合液、酶和内标物置于离心管，振荡后离心30s,吸取36μl混合液分装到八联管，并在上述管中分别加入细菌待检核酸，阴性对照品、阳性对照品各4μl,反应体系为40μl,盖好管盖，上机进行PCR扩增，扩增条件为37℃2min; 94℃2min; (93℃15sec; 60℃60sec采集荧光)40次循环。荧光通道选用羧基荧光素和6-羟基吡啶-2-羧酸通道。

1.2.4结果判定

1.2.4.1质控标准

阴性对照品，相应检测通道无Ct值，无明显扩增曲线；阳性对照品，Ct≤30,且具有S型扩增曲线，同时满足这两条，否则试验无效。弱阳性质控品测定为阳性。

1.2.4.2标本结果

若标本对应的荧光信号通道Ct≤38,且扩增曲线呈清晰的对数曲线，报告为阳性；若Ct值在>38～40或扩增曲线形态不规则，则标本重复检测1次，如Ct值仍在>38～40,报告为阴性。

1.2.5统计学分析

采用Jamovi 2.3.28软件进行处理，计数资料使用例/率/百分比进行描述，各合并感染率使用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05,

2、结果

2.1病毒检测结果

457份不明原因肺炎病例标本通过real-time fluorescence PCR检测后发现呼吸道合胞病毒阳性率最高为23.6%(108/457),流感病毒阳性率为13.6%(62/457),位居第二，其他病原体阳性率由高到低依次为人鼻病毒6.8%(31/457)、人偏肺病毒2.4%(11/457)、2019新型冠状病毒2.0%(9/457)、腺病毒2.0%(9/457)、副流感病毒1.1%(5/457)和H7N9病毒0.2%(1/457),未检出H5N1病毒、H9病毒、SARS冠状病毒、中东呼吸综合征(Middle East respi-ratory syndrome, MERS)冠状病毒和新型冠状病毒(EMC型)。见表1。

表1贵阳市不明原因肺炎中病毒的检测结果

2.2细菌检测结果

细菌检测结果阳性率由高到低分别为流感嗜血杆菌21.2%(97/457)、肺炎链球菌9.8%(45/457)、肺炎克雷伯杆菌3.3%(15/457)、肺炎支原体2.6%(12/457)、结核分枝杆菌1.5%(7/457)、百日咳杆菌0.2%(1/457)和嗜肺军团菌0.2%(1/457),未检出白喉杆菌和肺炎衣原体，见表2。

表2贵阳市不明原因肺炎中细菌的检测结果

2.3混合感染情况

病毒与细菌混合感染66份，混合感染率为14.4%;病毒与病毒混合感染9份，混合感染率为2.0%;细菌与细菌混合感染27份，混合感染率为5.9%,不同病原体混合感染检出率差异有统计学意义(χ2=53.955,P<0.001)。3种病原体混合感染14份，混合感染率为3.1%,混合感染中，呼吸道合胞病毒和流感嗜血杆菌混合感染最多，共40份，混合感染率为8.8%,其次为流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的混合感染，共24份，混合感染率为5.3%。其他混合感染见表3。

表3贵阳市不明原因肺炎中多种病原体的混合感染情况

3、讨论

不明原因肺炎的主要临床症状表现为发热伴肺部阴影，可由感染性和非感染性疾病中的多种病因引起[2],其蔓延程度大，影响范围广，对国民经济发展和社会稳定有重大影响。本中心实验室在以往的不明原因肺炎监测中按照相关方案要求进行检测筛查，发现很多标本未能检测出病原体。据报道约30%的呼吸道病例中，常规临床试验未检出病原体[3],为提高检出率，本研究期望通过增加检测病原体种类，发掘贵阳市不明原因肺炎病例中优势病原体及不同病原体间的混合感染情况。

本研究结果显示，贵阳市不明原因肺炎病例中，病原体总检出率为90.6%,远高于其他省市报道的阳性率。既往研究中，张掖市病原体阳性检出率为39.2%[4],内江市病原体阳性检出率为65.4%[5],黑龙江省病原体阳性检出率为40.0%[6]。其中检出病毒8种，病毒阳性率为51.6%,以呼吸道合胞病毒最为常见(23.6%),与王学娟等研究的以鼻病毒(8.3%)最为常见不同[7];检出细菌7种，与胡晓军等研究一致[8]。细菌的阳性检出率为38.9%,以流感嗜血杆菌检出率最高(21.2%),与河南省漯河市和广西壮族自治区口岸检出结果一致，但阳性率低于河南省漯河市的33.6%[9]、广西壮族自治区口岸的70.8%[10];其次是肺炎链球菌(9.8%)和肺炎克雷伯杆菌(3.3%),与以往报道的细菌检出顺位不同[4,5],可能与试剂盒所检测的病原体种类以及灵敏度不同，或者与贵阳市各种病源的流行情况不同等有关。

混合感染病例标本共98份，混合感染率为21.4%,混合感染率远高于单一病原体感染率，与其他省市相关报道一致[11,12,13],病毒与细菌混合感染66份，混合感染率为14.4%;病毒与病毒混合感染9份，混合感染率为2.0%,低于赵晓红等研究的混合感染率为4.0%的结果[14];细菌与细菌混合感染27份，混合感染率为5.9%;3种病原体混合感染14份，混合感染率为3.1%,高于曾同霞等研究的混合感染率为1.0%的结果[15]。呼吸道合胞病毒和流感嗜血杆菌混合感染最多，共40份，混合感染率为8.8%,其次为流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的混合感染。

本研究显示，呼吸道合胞病毒、流感病毒和人鼻病毒是不明原因肺炎病例的主要致病病原体，呼吸道合胞病毒的检出率最高，与崔爱利等研究结论一致[16]。呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿急性下呼吸道感染最重要的病原体[17]。全球呼吸道合胞病毒暴发疫情时有发生[18,19]。严重影响公共卫生健康，但至今仍无批准的疫苗上市[20]。此结果提示贵阳市呼吸道合胞病毒流行趋势严峻，提示临床、疾控中心和卫生行政部门应高度重视，以防呼吸道合胞病毒疫情暴发。

病原体检出率较低的有副流感病毒、腺病毒和人偏肺病毒，未检测出人感染高致病性禽流感病毒H5N1亚型、H9亚型、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒和新型冠状病毒(EMC型)。在细菌检测结果中发现流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的阳性率分别为21.2%和9.8%,肺炎克雷伯杆菌、百日咳杆菌、嗜肺军团菌和结核分枝杆菌检出率低，未检出白喉棒状杆菌和肺炎衣原体。细菌检测并未纳入贵阳市不明原因肺炎监测体系中，但细菌检测结果阳性率为39.2%,相对较高，将阳性率较高的几种细菌纳入儿科和老年科、ICU的院感监测系统中，可能会提高不明原因肺炎的临床诊疗质量。

本研究结果显示，贵阳市不明原因肺炎中，存在多种病原体混合感染情况，以病毒与细菌混合感染为主。多重病原体感染人体，可能形成复杂的致病机制[7]。病例的肺炎症状可能是由多种病原体混合感染引起的，临床医生对病例诊断时，应从多方面进行考虑，同时进行抗病毒和抗细菌治疗。在不明原因肺炎的诊疗中，及时发现病原体是最为关键的环节，real-time fluorescence PCR技术有快速、特异、灵敏的特点，是目前最为常见的实验室检测手段。单一的反应体系，每次只能检测1～2种病原体，若要进行多种病原体检测，效率不高。因此，医疗、卫生机构可根据本研究结果定制相应病原体的多重病原体检测试剂盒或微流体芯片，以提高不明原因肺炎病例的检测效率，使病例得到及时有效的治疗。

本研究也存在一定的局限性，本研究仅对不明原因肺炎病例样本进行常见的呼吸道病毒和细菌进行检测及分析，未对其他罕见或未知病原体进行检测，病原谱不够完整，也未对所检出的病毒和细菌进行基因特征分析；同时，未分析感染人群分布及发病季节性。在之后的研究中，还需纳入更多的病原体类型，对检出病原体基因型别做进一步的鉴定分析，为临床诊疗提供科学的实验依据。

利益冲突无

参考文献:

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