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肺腺癌中HPRT1基因表达对患者总生存的影响

2024-08-09 54 上传者：管理员

摘要：目的探索HPRT1基因在肺腺癌中的表达特征、总生存率、功能激活以及免疫浸润中的影响。方法通过对TCGA肺腺癌数据以及多个GEO数据库中的肺腺癌数据进行挖掘分析，对比并验证HPRT1表达量与预后总生存（overall surival,OS）的关系，通过cluster Profiler分析HPRT1基因高表达组中上调基因的功能富集情况。且通过TIMER以及CIBERSORT算法计算肺腺癌中不同免疫细胞的浸润水平并对比在HPRT1高低表达组间的浸润程度差异。结果 HPRT1在肺腺癌组织中表达量显著上调，且在TCGA中证明HPRT1基因高表达的患者预后OS更差（P <0.01）。经过2个GEO数据集的验证同样发现HPRT1基因高表达表现为预后OS更差（GSE13213,P <0.01;GSE67639,P <0.001）。差异分析显示高表达的患者中有683个基因的表达量显著上调且这些上调基因的功能主要富集与p53以及细胞周期等癌症相关的信号通路。TIMER以及CIBERSORT算法进行的免疫细胞浸润程度分析发现在高表达差预后人群中B细胞以及CD4T细胞含量均更低（P <0.05）。结论 HPRT1基因表达量越高肺腺癌患者的总生存越差，且高表达患者的p53信号通路上调，B细胞以及CD4T细胞浸润程度显著下降。

关键词：
HPRT1基因
临床诊疗
总生存
数据挖掘
肺腺癌
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肺癌始终是1个重要的世界性公共卫生及健康问题，基于全球癌种数据统计其中非小细胞肺癌类型占比接近80%～85%，非小细胞肺癌基于病理学特征分为肺腺癌以及肺鳞癌[1-2]。经过多年的精准医学转化研究以及基因组学研究，肺腺癌和肺鳞癌在临床诊疗中俨然成为2种非常不同的癌症类型。

肺腺癌已典型的激酶激活为主要驱动因素，其中包括EGFR、ALK、KRAS、BRAF、MET、ERBB2、RET、ROS1等重要基因，并在不同基因上均发现了多种热点变异并开发了相应的小分子抑制剂[3-5]。虽然临床中针对肺腺癌已经取得了非常显著的进展和突破，但是以小分子抑制剂为首的治疗方式较为依赖驱动变异的检出情况，且依然存在较高比例的患者未能检测到常见基因的驱动变异[6]。因此，针对肺腺癌患者影响治疗以及影响预后的分子特征仍需要进一步挖掘。

HPRT1基因可转录翻译成1种蛋白酶，主要参与细胞周期信号通路，而且是1种重要的蛋白质可为细胞生长提供必需的成分，在多种组织中高表达[7-8]。传统认为HPRT1为管家基因，但是越来越多研究表明该基因和多种类型的癌种存在关联，在头颈癌患者中过表达与不良预后相关[9]，还被发现该基因与癌细胞的化疗耐药相关并且被提议为化疗药物的治疗靶点[10]。因此本研究将通过多个数据集对HPRT1基因在肺腺癌中的预后关联、生存率、调控通路、免疫浸润特征等进行分析。

1、资料与方法

1.1 TCGA以及GEO中肺腺癌数据

本研究数据下载自TCGA数据库（https://xena.ucsc.edu/）[11]，其中包含共计493例肺腺癌原发灶的RNAseq表达量数据，表达量信息包含2种定量方式。测序得到的原始序列计数（Reads count）用于样本之间的差异分析，每百万份转录数（transcript per million,TPM）用于进行表达量高低的对比，该493例患者均具有完整的预后OS数据用于生存分析。另外纳入TCGA数据集中共计49例癌旁对照样本的表达量数据。基因表达综合数据库（gene expression ominibus,GEO）中提取了2个研究的数据包含GSE13213[12]以及GSE67639[13]，分别有116例及1 024例肺腺癌样本的表达数据以及预后OS数据。

1.2研究方法

1.2.1数据集定义

训练集：TCGA的493例肺腺癌数据用于本研究的训练数据集来探索HPRT1基因的表达与预后关联以及各类生物学特征的分析。验证集：GSE13213以及GSE67639 2个独立数据集主要用于验证HPRT1基因和预后的关联性。

1.2.2基因表达量分析

分析TCGA数据集中的493例肺癌样本与49例癌旁样本之间的HPRT1基因表达量差异，表达量的定量方式为TPM。

1.2.3 HPA分析肺腺癌中HPRT1蛋白的表达量

在The Human Protein Atlas(HPA)[14]数据库中检索HPRT1基因对应的抗体，并分别统计2种抗体在肺腺癌组织中的表达水平。

1.2.4基因与患者的预后生存分析

训练集TCGA数据以及GEO的独立验证集中均按照相同的标准对患者进行高表达以及低表达分组，然后在R语言软件（版本号为4.0.3）中使用survival算法包（版本号为3.2.13）对2组对高表达以及低表达患者进行比较分析。其中高表达定义为HPRT1基因表达量最高的30%患者，低表达定义为HPRT1基因表达量最低的70%的患者。多因素校正分析使用survival算法包中的Cox比例风险回归模型（cox proportional hazards regression model）进行计算。

1.2.5 OSluca进行基因预后的验证分析

OSluca[15]提供了汇总之后的GEO预后数据，通过该数据库进行了HPRT1在多个GEO数据集中与预后OS的关联性验证。

1.2.6差异表达以及功能富集分析

通过R语言软件中的DESeq2包（版本号为1.30.1）对TCGA数据集中HPRT1基因高表达组与低表达组之间的样本进行差异表达分析。其中Fold change大于2且adjust P value<0.05即为表达量上调。并通过ggplot2包对差异表达结果进行火山图绘制。基于上述差异表达基因的定义条件提取上调基因之后通过cluster Profiler包[16]（版本号为3.18.1）进行KEGG富集分析。

1.2.7免疫浸润分析

通过TIMER[17]以及CIBERSORT算法[18]对493例TCGA中肺腺癌患者的全部免疫细胞类型进行定量分析，并按照HPRT1基因的高表达与低表达分组进行各个细胞类型的含量差异分析。

1.3统计学处理

使用Wilcoxon test检验方法进行HPRT1基因表达量分组差异，免疫细胞含量分组差异比较，Log-rank test检验计算预后总生存（overall survival,OS）差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HPRT1基因在肺腺癌样本中表达情况

在TCGA数据集中共计有493例肺腺癌组织的转录组测序以及59例正常癌旁组织用于对照分析，通过对比肺癌组织与癌旁组织的HPRT1基因表达量（使用TPM进行定量，Transcript per million）发现该基因在肺癌组织中呈现出显著的高表达现象（P<0.001），见图1A。但将所有肺癌样本按照患者的肿瘤分期进行表达量分析发现，该基因的表达量并未随着分期增加而显著增加表达量，见图1B。为了进一步确认该基因在蛋白水平的表达情况，通过Human Protein Atlas数据库检索了HPRT1的蛋白表达结果发现，HPRT1基因抗体（HPA006360)IHC定量为高表达，见图1C。

2.2 HPRT1基因表达与肺腺癌患者预后生存关系

将提供了预后OS的TCGA中肺腺癌患者按照HPRT1基因表达量从高到低排序，其中前30%的患者定义为HPRT1基因高表达组，后70%患者定义为HPRT1基因低表达组。比较2组患者的预后OS发现HPRT1基因高表达组患者的预后显著更差（P<0.05），见图2A。为了进一步验证该基因可能独立影响到患者预后，联合患者的年龄、性别以及病理分期进行预后校正发现，经过多因素校正的Cox预后模型中HPRT1基因的高表达依然为显著预后因素（P<0.05），见图2B。

图1 HPRT1基因在肺腺癌样本中表达情况

图2 HPRT1基因表达与肺腺癌患者预后生存关系

2.3 HPRT1基因表达与肺腺癌患者预后关系

为进一步确定HPRT1基因与肺腺癌患者的预后关系是否存在样本集偶然因素，通过检索GEO数据库中HPRT1基因表达谱以及预后OS发现在多个独立数据集中发现HPRT1基因的高表达患者预后更差所示不同数据集中HR>1，见图3A。数据集GSE13213以及GSE67639结果显示在各自HPRT1基因高表达的30%患者中其预后OS均更差（P<0.01,P<0.001），见图3B。

2.4 HPRT1基因高表达、低表达患者组之间基因功能分析

按照高表达的30%患者即为预后较差的患者定义为高风险组，其余低表达的70%患者定义为低风险组。比较2组患者中的差异表达基因发现在高风险组中有683基因发生了显著上调，见图4A。通过KEGG富集分析发现该组上调的基因其功能显著富集于细胞周期以及p53信号通路，见图4B，提示在高风险组的患者中细胞周期以及p53相关功能通路处于更高的激活状态。

2.5 HPRT1高表达组患者的免疫微环境的特征分析

基于TIMER算法分析高、低风险组不同的免疫细胞类型浸润程度。发现B细胞以及CD4T细胞在高风险组中富集的含量更少（P<0.001），见图5A、5B。通过CIBERSORT算法的分析验证了该结果，发现多类B细胞，见图5C。以及CD4T细胞，见图5D，在高风险组中更低（P<0.001），提示HPRT1高表达所代表的高风险患者存在显著更低的免疫细胞浸润特点。

3、讨论

本研究通过对TCGA肺腺癌数据中的表达谱以及临床信息进行广泛的数据挖掘分析发现HPRT1基因在肺腺癌中显著上调，且表达量越高的患者其临床中表现为预后总生存越差，该结果提示肺腺癌患者中HPRT1基因的表达量会显著的影响到患者的生存情况。且该研究发现经过多个临床因素的校正证明其不受到常见临床特征的影响，是可独立影响到肺腺癌患者预后的关键指标。本研究在多个数据队列中也进一步验证了该基因的发现，证明了该结果的稳定性以及可靠性。

既往已有研究表明HPRT1基因在头颈癌以及卵巢癌中均为预后差的关键因素，且该基因编码的蛋白是参与细胞周期活动的重要成本[19]。本研究进一步分析发现HPRT1基因高表达的患者会显著上调p53以及细胞周期信号通路，与既往研究结论一致[9]。因此推测该基因会通过上调p53以及细胞周期等癌症高度相关的细胞通路活性，促进肿瘤细胞的生长和存活从而影响到治疗效果。因此在临床实践中，抑制该基因的表达可能成为改善HPRT1基因高表达肺腺癌患者临床疗效的一个有效措施。

肿瘤的生长永远处在与患者免疫功能斗争的过程中，且肿瘤中免疫细胞浸润越强则杀伤肿瘤细胞的潜力越大对肿瘤细胞的抑制作用也更为明显[20]。相反如果肿瘤环境中较少有免疫细胞的浸润，则表现为免疫功能的活性较弱进而其肿瘤抑制的程度越弱。本研究也针对HPRT1基因高表达的患者和低表达的患者进行了多种免疫细胞的浸润程度对比。通常患者的免疫微环境会与患者的整体生存有着较强的关联性，免疫细胞活跃的肿瘤中患者的整体预后会更优。为了进一步解释HPRT1基因高表达呈现出来预后更差的可能因素，故笔者使用TIMER算法分析，发现B细胞以及CD4T细胞均在HPRT1基因高表达这类预后差的患者中呈现了显著更低的特点。即表明HPRT1高表达所表征的差预后人群呈现出了一定程度的免疫浸润更差的现象，通过CIBERSORT算法分析提示了完全一致的结果。因此笔者为HPRT1高表达多表征的差预后人群找到了另1条差预后的可能原因，进而为改善临床疗效提供了1个备选思路。

图3 HPRT1基因表达与肺腺癌患者预后关系

综上所述，本研究发现了肺腺癌中存在1个显著上调的基因即HPRT1且该基因的表达上调会在肿瘤患者中表现为p53以及细胞周期信报通路的过度激活，B细胞以及CD4T细胞也会呈现出浸润程度的下降。患者的整体预后也会随着HPRT1基因的表达量升高而显著下降。

图4高表达、低表达HPRT1基因之间功能分析

图5 HPRT1高表达组免疫微环境特征分析

参考文献:

[20]朱中山,杨洲,江承川,等.肺腺癌患者PLA2G1B表达情况与预后的相关性[J].昆明医科大学学报,2022,43(9):70-76.

基金资助:湖南省自然科学基金科卫联合基金资助项目(2020JJ8080);

文章来源:杨红秀,朱中山.肺腺癌中HPRT1基因表达对患者总生存的影响[J].昆明医科大学学报,2024,45(08):17-23.