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降低lncRNA-RMRP表达抑制人肺癌细胞系A549的增殖和侵袭

2024-07-02 13 上传者：管理员

摘要：目的探讨抑制线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分(RMRP)表达对人肺癌细胞系A549增殖和侵袭的影响；检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者全血和组织中RMRP表达，比较在不同临床指标表达差异性，以期为NSCLC机制研究提供参考资料。方法收集2016年3月至2021年3年在焦作市人民医院行手术治疗的NSCLC患者122例，同期，在体检中心选取健康者50名作为对照组。RT-qPCR检测全血和组织中RMRP mRNA水平。培养A549细胞分为si-RMRP组、siRNA-NC组和空白组(blank组)。RT-qPCR、CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞中RMRP表达、增殖活性和侵袭细胞数。结果 NSCLC患者全血中RMRP相对表达量显著高于对照组(P<0.001);NSCLC组织中RMRP相对表达量高于癌旁组织(P<0.001);低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量较高分化、未发生淋巴结转化和TNM分期Ⅰ～Ⅱ明显升高(P<0.05);Si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量低于空白组(blank组)和siRNA-NC组(P<0.001);相比与blank组和siRNA-NC组，24、48、72和96 h时si-RMRP组细胞吸光度(A)值均降低(P<0.05);Si-RMRP组细胞侵袭数低于blank组和siRNA-NC组(P<0.001)。结论 NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量升高，下调A549细胞中RMRP基因表达可抑制细胞增殖，减少细胞侵袭。

关键词：
RMRP
增殖
线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分
长链非编码RNA
非小细胞肺癌
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肺癌(lung cnacer)在中国居民恶性肿瘤中发病率和病死率均居第一位[1],其中，非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)是占比最多的病理学类型。目前，手术依然是治疗NSCLC主要手段，但多数患者不易早期发现而错失最佳切除时机[2],有超过一半的NSCLC患者在确诊时已发生转移[3]。因此，早期发现及诊断是提高NSCLC患者治疗效果及改善预后的关键。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为长度在200 nt以上的一类不具备蛋白编码作用的RNA,在NSCLC组织中存在表达异常[4]。LncRNA可能是一种理想的无创外周血生物标志物，用于早期识别NSCLC患者[5]。线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分(RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease, RMRP)作为一种lncRNA,在癌进程中发挥重要作用，可充当致癌作用促进肿瘤细胞增殖和侵袭[6]。本研究通过检测NSCLC患者全血和组织中RMRP表达，比较不同临床指标间表达差异性，并观察对NSCLC细胞增殖和侵袭情况的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例：收集2016年3月至2021年3年在焦作市人民医院行手术治疗的NSCLC患者，纳入标准：1)术前未行放化疗治疗；2)影像及病理学检查确诊。排除标准：1)其他病理学类型的肺癌者；2)心肝肾等重要脏器严重功能不全者；3)合并有其他系统恶性肿瘤者。共122例，男性72例，女性50例，年龄35～74岁，平均年龄(58.0±9.4)岁，病理学类型：鳞癌73例，腺癌49例；分化程度：低分化51例，中分化41例，高分化30例；发生淋巴结转移43例。同期，体检中心健康体检者50名作为对照组，男性28例，女性22例，平均年龄(57.8±9.0)岁，与NSCLC患者在性别、年龄差异无统计学意义。本研究通过医院医学伦理委员会批准(批号：JZSRMYY20150809003),所有研究对象均行知情同意。

1.1.2 人肺癌细胞系A549(中科院上海细胞生物所)。

1.1.3 试剂(盒):总RNA提取液(广州东盛生物公司);First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司);SYBR GreenⅡ 荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司);细胞裂解液(上海康朗生物科技有限公司);10%胎牛血清(上海索桥生物公司);RPMI-1640培养液(Gibco公司);Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen公司);CCK-8(北京杰辉博高生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测全血中RMRP表达水平：

取NSCLC患者和对照组晨起空腹肘静脉血6 mL,用总RNA提取液提取总RNA,并用紫外分光光度计测定纯度。取合格总RNA用First Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA,按试剂盒说明进行扩增，反应条件：95 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 73 ℃ 30 s, 36次循环。引物序列：RMRP:上游：5′-CAGAGAGT GCCACGTGCATA-3′;下游：5′-CTAGAGGGAGCTG ACGGATG-3′;GAPDH:上游：5′-CTCCTGCATGC CACGGA-3′,下游：5′-AGACCCTTACAGTTAGTCGT-3′,引物由上海生工生物公司合成。使用2-△△Ct法计算RMRP相对表达量。

1.2.2 RT-qPCR检测组织中RMRP表达水平：

术前取NSCLC患者肿瘤组织和距离肿瘤边缘>3 cm癌旁组织(经病理学检查排除肿瘤),剪成小块后冻存在液氮中。取组织，用液氮碾碎后，加入细胞裂解液。

1.2.3 细胞的分组及转染：

将A549细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(含1%青-链霉素)在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞增殖至汇合度>80%时，消化、传代。将处于对数增殖期细胞按2.5×105个/孔接种在6孔板，采用Lipofectamine 2000转染试剂按照说明书对不同组细胞分别开展转染：1)Si-RMRP组：转染RMRP的siRNA序列：5′-CCUAGGCUACACACUGAGGACUTT-3′;2)SiRNA-NC组：转染siRNA对照序列：5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3′;3)空白组(blank组):转染空质粒。转染后培养48 h。

1.2.4 RT-qPCR检测细胞中RMRP表达水平：

取各组转染后48 h细胞，加入细胞裂解液。实验重复5次。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖活性：

用胰蛋白酶对各组对数增殖期细胞消化，制成浓度1×104个/mL的细胞悬液，按200 μL/孔接种于96孔板，每组设置6个复孔。分别在12、24、48、72和96 h时间点时，各孔加入10 μL的CCK-8,培养4 h, 用酶标仪取450 nm波长测定各孔吸光度(absorbance, A)值。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭：

用Transwell方法进行。将基质胶用无血清培养液按9∶1稀释后，铺在Transwell小室底部，过夜风干。用无血清培养液制备5×104个/mL的细胞悬液，将200 μL悬液加入小室上室，下室中加入含10%胎牛血清的培养液，培养24 h, 取出小室，将表面散落细胞轻轻擦除，PBS冲洗、固定、结晶紫染色，镜下观察，在高倍镜下取6个视野，对穿膜细胞数进行计数。重复实验3次。

1.3 统计学分析

利用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料经正态性检验且符合正态分布，以均数±标准差

表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组内两两比较LSD-t检验。当P<0.05时视为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 两组患者全血和组织中RMRP表达

NSCLC患者全血中RMRP相对表达量为(4.30±0.92)显著高于对照组的(3.52±0.85),差异有统计学意义(t=5.178,P<0.001)。

NSCLC组织中RMRP相对表达量(2.50±0.25),比癌旁组织(1.02±0.12)明显升高(t=59.756,P<0.001)。

2.2 不同临床指标NSCLC患者全血和组织中RMRP表达

不同性别、年龄、是否吸烟、肿瘤大小和病理学类型NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量差异无统计学意义，低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量较中高分化、未发生淋巴结转移和TNM分期Ⅰ～Ⅱ明显升高(P<0.05)(表1)。

2.3 三组细胞中RMRP表达

Si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量为(0.19±0.08),低于blank组的(1.03±0.06)和siRNA-NC组的(1.02±0.05)(F=330.392,P<0.001)。

2.4 三组细胞增殖活性

相比与blank组和siRNA-NC组，24、48、72和96 h时si-RMRP组细胞A值均降低(P<0.05)(图1)。

2.5 三组细胞侵袭能力

Si-RMRP组细胞侵袭数为(90±8)个，低于siRNA-NC组的(120±10)和blank的(123±8)(F=27.765,P<0.001)(图2,3)。

3、讨论

NSCLC发病机制复杂，涉及基因、环境、遗传、生活习惯等诸多因素[7],虽然临床上治疗NSCLC的手术及放射治疗和化学治疗(放化疗)方案不断优化，但患者治疗后复发率高、病死率高，5年生存率依然维持在较低水平[8],究其原因，与患者早期症状不显著，加之现有的筛查手段存在一定创伤性，不易开展大规模人群筛查等关系密切[9]。

表1 不同临床指标NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量比较

图1 三组细胞不同时点增殖活性比较

LncRNA是广泛存在于机体内的一类长链RNA,在NSCLC进展中发挥重要调控作用，并与患者预后评估及对化疗和靶向药物的抗药性密切相关[10]。RMRP是位于人染色体9p13.3的lncRNA,在调控细胞周期、核糖体合成及线粒体DNA复制中发挥重要作用[11],参与了膀胱癌[12]、结直肠癌[13]等诸多恶性肿瘤病程。本研究显示，NSCLC患者全血中RMRP相对表达量高于对照组，且NSCLC组织中RMRP相对表达量相比与癌旁组织明显升高，说明RMRP在NSCLC患者全血及肿瘤组织中出现了表达异常，同时，低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量明显升高，进一步表明，RMRP异常高表达可能参与了NSCLC恶性进程。

图2 Transwell小室检测显示si-RMRP组侵袭细胞减少

图3 三组细胞侵袭数比较

本研究为明确RMRP在NSCLC中的作用，采用siRNA技术抑制A549细胞中RMRP基因表达。结果表明，si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量显著降低，细胞中RMRP表达被成功抑制。本研究结果显示，相比与siRNA-NC组和空白组si-RMRP组细胞A值均降低，说明抑制RMRP基因表达可减少A549细胞增殖活性。RMRP可能作为肿瘤启动子，通过调节miR-613/NRP2轴加速食管鳞状细胞癌的细胞侵袭[14]。本研究结果表明，抑制细胞中RMRP基因表达，细胞侵袭数量显著减少。这些结果表明，RMRP可能参与了A549细胞增殖和侵袭过程。

综上所述，NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量升高，抑制A549细胞中RMRP基因表达可抑制细胞增殖，减少细胞侵袭，但其可能涉及的作用机制尚待开展进一步的研究。

参考文献:

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[8]杨晔,党荣广,张静,等.肺癌组织中lncRNA ZFAS1和hsa-miR-372-3p的表达与患者恶性特征及预后的关系[J].基础医学与临床,2022,42:1861-1866.

[9]秦维超,张琳.非小细胞肺癌组织miR-25表达变化及其临床意义[J].山东医药,2020,60:63-65,87.

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基金资助:2020年河南省科技攻关项目(LHGJ20200835);

文章来源:郑红,陈晓霞,韩李周,等.降低lncRNA-RMRP表达抑制人肺癌细胞系A549的增殖和侵袭[J].基础医学与临床,2024,44(07):974-978.