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TCOF1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

2024-09-09 22 上传者：管理员

摘要：目的:通过生物信息学分析、免疫组织化学实验和临床资料分析，探讨细胞质核糖体生物发生因子(treacle ribosome biogenesis factor 1,TCOF1)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的差异表达、预后价值和生物学功能。方法:利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据，分析了TCOF1在HCC组织中的表达水平，并探讨了与患者预后的相关性。通过免疫组化检测107例HCC患者TCOF1的表达，分析其临床意义。利用Kaplan-Meier曲线分析了TCOF1表达与HCC患者预后的关系。通过单因素和多因素Cox回归分析筛选出影响HCC患者预后的独立影响因素，建立了预测模型，并绘制列线图可视化预测模型。采用基因集富集分析(GSEA)探究TCOF1的生物学功能。结果:TCOF1在HCC组织中的表达水平明显高于正常肝脏组织(P<0.001),此外高水平的TCOF1与患者不良预后密切相关(P<0.05)。单因素、多因素Cox回归分析显示，高水平纤维蛋白原(Fg)(HR=1.520,95%CI=1.166～1.981,P=0.002)、PATA评分(HR=1.048,95%CI=1.004～1.094,P=0.031)和TCOF1 (HR=11.126,95%CI=1.002～1.265,P=0.046)是影响HCC患者预后的独立危险因素。构建预后模型并绘制列线图来预测HCC患者1、3、5年总生存期(overall survival, OS)。免疫组化结果显示TCOF1在肿瘤组织中呈阳性表达，而在癌旁组织中呈弱阳性或阴性表达；GSEA富集分析结果提示TCOF1可能参与卵母细胞减数分裂、p53信号通路等9条信号通路。结论:TCOF1在HCC组织中高表达，与患者的不良预后相关，表明TCOF1可能是评估HCC患者预后的潜在生物标志物。

关键词：
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TCOF1
列线图
肝癌
预后
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原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)每年新增病例超过86万人，死亡病例超过75万人，是目前最常见的消化道肿瘤及最主要的肿瘤致死原因之一[1]。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC )占全球PLC的80%以上[2]。根据预测，2020年至2040年，每年新发肝癌病例数将以55.0%的增长率递增，到2040年可能有140万人被确诊，将有130万人因肝癌而丧生[3]。手术切除是 HCC 主要的根治性治疗手段，但是其预后仍不甚理想，5年复发率最高可达 70%[4]。大量研究表明， HCC是一种涉及遗传和表观遗传变化的复杂疾病，分子生物学检测对提高HCC的早期诊断率和预后具有重要作用[5]。因此，寻找新的潜在靶点，识别与HCC预后相关的癌基因，对改善患者预后具有重要临床意义。

细胞质核糖体生物发生因子1(treacle ribosome biogenesis factor 1,TCOF1)是一种细胞核内调节真核生物核糖体RNA(ribosomal DNA,rRNA)转录的核仁因子，位于染色体5q32-q33.1,共包含28个外显子，编码糖蜜磷酸化蛋白[6]。近年来研究发现， TCOF1在多种肿瘤中高表达，并影响患者预后[7]。HU J[8]等发现TCOF1在三阴性乳腺癌中上调可促进干细胞和肿瘤生长，并与不良预后相关；NIE X[9]等发现 TCOF1在胃癌中表达上调并与肿瘤细胞增殖相关；ZHU G[10]等研究发现TCOF1可通过调控上皮间质转变从而影响HCC进展。综上，TCOF1可能是一种潜在的生物标志物和治疗靶点。然而，TCOF1在HCC中的预后价值和具体机制不明确，需进一步研究。本研究旨在使用生物信息学方法结合免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)检测分析TCOF1基因在HCC中的表达水平与预后相关性，并探讨其可能的分子机制。

1、材料与方法

1.1 基于TCGA数据集进行生物信息学分析

通过UCSC Xena公共数据库(http: //xena.ucsc.edu/)下载癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)中HCC的基因表达数据、临床资料和预后信息。数据处理后，获得421例样本数据，其中正常样本50例，肿瘤样本371例。利用基因表达谱和交互分析数据库(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)等公共数据库验证TCOF1在HCC中的差异表达情况及预后相关性。

1.2 临床组织样本

回顾性收集2014年01月到2019年12月贵州医科大学附属医院107例患者的数据。纳入及排除标准如下，纳入标准：(1)接受肝切除手术治疗；(2)术后病理结果证实为HCC;(3)没有淋巴及远处转移；(4)术前没有接受其他治疗。排除标准：(1)病理结果不明确；(2)患者临床指标及随访资料不完整；(3)因其他原因失访或死亡。所有患者生存资料均通过电话随访获得，最短随访时间为3年。

1.3 免疫组化

对石蜡包埋的组织样本切片后进行脱蜡和水化。利用柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L)高压12分钟进行抗原修复，待自然冷却至室温后，用硫酸盐缓冲液(PBS)洗涤3分钟×3次。再用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性。用牛血清白蛋白(BSA)封闭后，加入稀释的一抗，在4 ℃下孵育过夜。次日加二抗，室温敷育50分钟，PBS缓冲液洗涤5分钟×3次。DAB显色、苏木素复染、0.1%的盐酸乙醇快浸2秒，立即转入PBS中，流水冲洗20分钟返蓝，通风橱中阴干，中性树脂封片。每张切片随机选取8个高倍视野，由两位病理科专家在不知道患者资料的情况下，采用半定量的办法对免疫组化结果进行评估。总得分=染色强度×染色面积。染色程度评分规则如下：无着色=0分，浅黄色=1分，浅褐色=2分，深褐色=3分；阳性范围评分规则如下： <5%=0分，5%～25%=1分，26%～50%=2分，51%～75%=3分，76%～100%=4分。

1.4 基因集富集分析(GSEA)

首先，使用R软件“limma”包对 TCGA 数据进行差异分析，通过分析癌组织与正常组织鉴定出差异表达基因(differential expression genes, DEGs),设置的筛选条件为|LogFC|>1.5,P<0.05。然后，通过加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)对DEGs进行分析，确定与TCOF1表达相关的核心模块和枢纽基因。最后，利用GSEA软件进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)探索TCOF1的生物学功能。

1.5 统计学分析

本研究使用SPSS27.0.1.0软件、R 4.3.2软件和Graphpad Prism 9.5.0软件进行数据处理、统计分析和图表绘制。首先，通过秩和检验分析TCOF1与患者临床病理特征之间的关系；然后，通过R软件中的“Survival”和“survminer”包绘制Kaplan-Meier 生存曲线和Log-rank检验比较TCOF1 表达与患者预后的关系。随后，使用“plyr”和“dplyr”包进行单因素和多因素Cox回归分析，确定总体生存率(overall survival, OS)的独立影响因素。随后，使用 “rms”“Survival”“timeROC”和“ggplot2”等包，根据筛选出的独立影响因素对OS的贡献进行评分，构建预测模型，并绘制列线图可视化预测模型。最后，通过计算C 指数和绘制时间依赖的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)来评估列线图的预测性能。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TCOF1在HCC组织中高表达

通过对421例TCGA样本的TCOF1表达谱数据进行分析，发现TCOF1在肝癌组织中的表达明显高于正常组织(图1A)。对107例患者的免疫组化结果进行分析，发现在肝癌组织中 TCOF1 的表达明显比癌旁组织高(图1B)。具有代表性的免疫组化图像如图1C所示(P<0.000 1)。

图1 TCOF1在HCC组织中的表达

2.2 TCOF1表达水平与患者临床病理特征的相关性

对107例患者的TCOF1表达情况和临床病理特征进行统计分析。我们发现，TCOF1的表达情况与患者术后复发相关，与T分期、CNLC分期等无明显相关性(表1)。

2.3 TCOF1高表达是HCC患者预后不良的独立危险因素

通过Kaplan-Meier 曲线对HCC患者的OS进行分析。结果显示，GEPIA数据库中，TCOF1高表达的HCC患者的总体生存时间明显比低表达的患者短(P=0.003 7,图2A);107例临床样本中，TCOF1高表达组患者的 OS显著低于TCOF1低表达组(P=0.008 9,图2B)。

对107例患者的临床资料进行单因素Cox回归分析，发现年龄、肿瘤大小、分化程度、术后复发情况、纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)、PATA 评分和 TCOF1 表达情况与 HCC 患者的OS相关(图3)。多因素Cox回归发现，Fg、 PATA评分和TCOF1的表达情况是 HCC 患者 OS 的独立影响因素[11](图4)。

表1 TCOF1与HCC患者临床病理特征之间的关系n(%)

2.4 列线图预测HCC患者的预后

首先，基于上述影响HCC患者OS的独立危险因素构建预测模型，通过绘制列线图将模型可视化(图5A),并计算出C指数为0.711。然后，通过绘制时间依赖的ROC曲线，计算出预测1、3、5年OS的曲线下面积 (area under curve, AUC)分别为0.733、0.744、0.773(图5B)。

2.5 相关性及富集分析

首先，通过差异分析鉴定出5 661个DEGs(上调基因 4 740个，下调基因921个)。然后，使用WGCNA识别出与TCOF1表达相关的暗青色核心模块。最后，通过对暗青色模块中的218个Hub基因进行GSAE分析发现，与TCOF1高表达相关的基因主要参与卵母细胞减数分裂、赖氨酸退化、系统性红斑狼疮、同源重组、朊病毒疾病、泛素介导的蛋白水解、黄体酮介导卵母细胞成熟、细胞周期、p53信号通路等9条通路(图6)。

3、讨论

HCC作为最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下。虽然其治疗方式多样，但术后复发和耐药等因素严重影响患者的预后[12]。因此，寻找新的治疗靶点和预后标志物对改善患者预后具有重要意义。

TCOF1是一种调节真核生物 rRNA转录的核仁因子。现有研究发现，TCOF1参与核糖体生物发生、DNA损伤反应、有丝分裂调节和维持端粒完整性等多个生物学过程[13]。以往研究认为TCOF1主要在Treacher Collins综合征发生、发展中起作用[14]。然而，越来越多的研究发现，TCOF1 在肝癌等多种肿瘤中表达升高，并提示患者预后不良[15]。WU C[16]等人通过体内和体外实验进一步证实 TCOF1 可以促进 HCC 肿瘤发生，并且 TCOF1 高表达可能与患者不良预后相关。本研究首先通过对421例TCGA数据和107例临床样本进行分析，验证了TCOF1在HCC中高表达，且与患者不良预后相关，这表明TCOF1可能是潜在的预后标志物。随后，在对临床样本进行临床病理特征相关性分析时，发现 TCOF1 表达水平与患者术后是否复发相关，与患者肿瘤大小和病理分期等临床指标无明显相关。这与WU C[16]等人的研究结果不一致，导致这一结果的原因可能是本研究样本量较小和样本个体差异所致。在进一步的研究中，我们将通过收集多中心数据扩大样本量，以提高模型的准确性。然后，单因素和多因素Cox回归分析发现Fg、 PATA 评分和 TCOF1 表达水平是HCC患者预后的独立影响因素。Fg在肝细胞中合成，是重要的凝血因子，其增高可见于肿瘤和慢性感染[17]。以往研究表明，Fg在评估肿瘤患者预后方面具有重要临床意义[18]。邓建忠[19]等人研究发现，Fg可以与淋巴细胞计数、血小板计数等血液指标组成综合性指标用于评估结直肠癌患者的预后。这与本研究结果一致。PATA是由YU M[20]等人开发的综合性评分，用于评估慢性乙型肝炎急性加重患者发生慢性加急性肝衰竭的风险(计算公式：PATA=0.341+3.111×凝血酶原时间(PT)+0.595×年龄(Age)+0.626×总胆红素(TBil)-0.295×谷丙转氨酶(ALT)。目前关于PATA评分评估HCC预后的研究未见报道。最后，利用临床样本数据构建了预测 HCC 患者预后的列线图模型，并通过绘制时间依赖的ROC 曲线发现其能较为准确地评估患者预后。上述结果表明，TCOF1高表达与HCC患者不良预后有关，有可能成为预测HCC患者预后的潜在分子标志物。

为探讨TCOF1在HCC进展中的潜在分子机制，本研究对TCOF1及其表达相关基因集进行了GSEA富集分析。结果显示，TCOF1及相关基因主要富集于卵母细胞减数分裂和p53信号通路。虽然CALO E[21]等人的研究发现TCOF1可以通过p53介导的细胞凋亡影响Treacher Collins综合征的发生，但关于TCOF1是否可以通过卵母细胞减数分裂、p53信号通路等途径调控HCC的发生和发展尚未有报道。为今后研究提供理论依据。

图2 HCC患者OS的Kaplan-Meier曲线

图3单因素Cox回归分析的森林图

图4多因素Cox回归分析的森林图

图5列线图及其评估

图6 TCOF1基因集富集分析(GSEA)

综上所述，本研究通过分析TCGA数据和临床样本，发现TCOF1在肝癌组织中高表达并提示患者预后不良。进一步分析显示，TCOF1表达水平是影响HCC患者预后的独立危险因素，表明其有可能成为预测HCC患者预后的潜在生物标志物。GSEA富集分析结果进一步揭示TCOF1可能通过卵母细胞减数分裂、p53 信号通路等促进HCC进展，为深入探究TCOF1在HCC发生和发展过程中的作用机制提供了理论基础。

参考文献:

[18]张雪,张革红.白蛋白､前白蛋白与纤维蛋白原的比值在肿瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(20):3880-3884.

[19]邓建忠,金建华,陆文斌,等.术前外周血纤维蛋白原水平联合血小板与淋巴细胞比值的评分对结直肠癌中预后的评估价值[J].医学研究生学报,2020,33(03):274-279.

基金资助:国家自然科学基金地区项目(编号:82260535);

文章来源:付相玉,江致贤,严芝强,等.TCOF1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(19):3712-3718.